【正文】 ter, cells were harvested by centrifugation (6,000 3 g for 60 min at 4176。 Sigma Aldrich, Steinheim, Germany) precipitation step to remove humic acids and carbohydrates. Surface water (30 liters) from Lake Kleiner Plo168。 Millipore, Bedford, Mass.), and cells were collected on a Durapore filter (pore size, mm。C) and thawed (5 min at 30176。 DNA was extracted with Chelex 100 and further purified with CTAB . DNA from sediment (Lake Kleiner Plo168。C, a “touchdown” PCR was performed (Thermocycler 2400。C was performed. During the first 10 cycles, the annealing temperature was decreased by 176。C. The amplification products were analyzed by electrophoresis on 2% (wt/vol) agarose gels (Boehringer, Ingelheim, Germany) followed by a 15min staining with ethidium bromide ( mg liter21). Sequencing of amplified nir products. For DNA sequencing, amplified PCR products from pure cultures were purified with the QIAquick PCR purification kit (Qiagen, Hilden, Germany) as specified by the manufacturer. DNA sequences were determined by direct sequencing of purified PCR products with the cyclesequencing kit (GATC, Konstanz, Germany) and Thermosequenase (Amersham, Braunschweig, Germany) as specified by the manufacturers. Labeling was performed by terminating the polymerization with biotinlabeled dideoxynucleoside triphosphates. After a denaturing step of 4 min at 94176。C. The sequencing products were blotted with a direct blotting apparatus (GATC) onto a nylon membrane. The separated products were visualized by an enzymelinked streptavidinbiotin coupling assay with a streptavidinalkaline phosphatase conjugate(GATC)and NBT/Xphosphate (Boehringer, Mannheim, Germany) as specified by the manufacturers. The sequences obtained were pared with published nirK and nirS sequences in the EMBL Nucleotide Sequence Database by FASTA analysis of the HUSAR program package based on the Geics Computer Group sequence analysis package . Hybridization analysis of nir products from total DNA of environmental samples. Approximately 100 ng (pure cultures) or 250 ng (environmental samples) of PCR product was analyzed on an agarose gel (2%, wt/vol). After electrophoresis, the DNA was transferred onto a positively charged nylon membrane samples. Approximately 100 ng (pure cultures) or 250 ng (environmental samples) of PCR product was analyzed on an agarose gel (2%, wt/vol). After electrophoresis, the DNA was transferred onto a positively charged nylon membrane (QIAbrane Nylon Plus。C for nirK and 46176。已知的近紅外型硝化實驗室培養(yǎng)可以得到證實。對于每個的兩個基因，成功擴增引物組合至 少有一個為所有測試菌株。這是每個 nir 基因在本研究開發(fā)的水生生物棲息地的總 DNA 的一個普遍擴增引物組合。它會導(dǎo)致在肥料應(yīng)用的主要農(nóng)業(yè)土壤的氮素?fù)p失。反硝化細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育多樣。催化亞硝酸鹽還原為 NO可以由兩個不同的亞硝酸鹽還原酶基因的產(chǎn)品：一個產(chǎn)品含有銅（ nirK基因產(chǎn)品），和其他含有色素 CD1（ NIRS產(chǎn)品）。 nirK 基因中只有 30％的反硝化細(xì)菌的研究迄今發(fā)現(xiàn)的。非常具體的檢測，主要是在應(yīng)變水平，可實現(xiàn)對異化硝酸鹽還原酶的血清（ dNirS ， 24，29和 dNirK ）。與一對引物，針對 NIRS 亞硝酸鹽還原酶基因的 PCR 方法具有較高的特異性比雜交實驗。 材料與方法 細(xì)菌的生長條件。假單胞菌，產(chǎn)堿菌，副球菌，固氮螺菌菌株和反硝化隔離 IFAM 3698基因組 DNA的提取，增加營養(yǎng)肉湯（ NB。紅假單胞菌 FSP?；蚪M DNA提取。 準(zhǔn)備從 5個樣品的 DNA。C 下厭氧條件下， 500毫升的濃縮再次接種和相同的生長條件下保存。 168。 Sigma Aldrich公司， Steinheim，德國）沉淀步驟去除腐殖酸和碳水 化合物。 Millipore公司）。C）。C） 1冰鮮丙酮體積為 30分鐘，并保持在冰上。 集中由切向流過濾（ 31）從 10公升湖水湖 Plussee，石勒 蘇益格 荷爾斯泰因州，德國于 1996年 8月在 9米的深度收集細(xì)胞。收集在 1996年 4月），是由與一個額外的蛋白酶 K 處理方法（ 50毫升 20毫克 ML21解決方案），面包車 Elsas 和 Smalla 分離后與 SDS 的潛伏期。 變性步驟 5分鐘后，在 95176。C間， 40秒一步的引物退火，延伸 40秒，在 72176。在第 10個循環(huán)，退火溫度降低 176。C。測序擴增近紅外產(chǎn)品。經(jīng)過 4分鐘的變性步驟 94176。C。 從環(huán)境樣品總 DNA雜交分析，近紅外產(chǎn)品。電泳后， DNA被轉(zhuǎn)移到一個帶正電的尼龍膜（ QIAbrane尼龍加 。近紅外產(chǎn)品進行純化，由生產(chǎn)廠家指定使用 QIAquick 凝膠提取試劑盒（ Qiagen）洗脫瓊脂糖凝膠帶。C 孵育過夜雜交經(jīng)過雜交，洗膜兩次，在室溫下在 5分鐘 100毫升含有 23 SSC（ 13 SSC是 M氯化鈉加檸檬酸鈉 ） ％（重量 /體積） SDS 和 45兩次的解決方案 176。核苷酸序列號。這里，我們描述了反硝化細(xì)菌檢測水生生物棲息地，由兩個截然不同的 PCR 系統(tǒng)使用的亞硝酸鹽還原酶基因， nirK基因和 NIRS的第一步。為此，亞硝酸鹽還原酶，其基因已被用于幾位作者，因為這是在反硝化過程中的關(guān)鍵酶。由于誘導(dǎo)性質(zhì)的酶，抗血清可檢測主動脫硝的條件下非常有用。富集的文化，不同 人群的 denitri fiers 可檢測限制性內(nèi)切酶消化籌備工作的總 DNA（酶切）與近紅外光譜探頭。這可能是因為 PCR 擴增引物雜交區(qū)域的同源性是決定性的，而基因探針雜交，可以檢測，如果探頭任何地區(qū)，顯示出足夠的同源性。設(shè)計簡并引物，兩側(cè)的兩個基因的高度保守的 C 端區(qū)域。發(fā)現(xiàn)這兩個基因是在一個給定的應(yīng)變相互排斥，這是一致的。一般來說，測序顯示，從底漆的雙 nirK1F nirK5R和nirS1FnirS6R 純文化的產(chǎn)品含銅和細(xì)胞色素 CD1含有亞硝酸鹽還原酶編碼基因的特異片段。在幀刪除或插入至 18基點，可觀察到測序區(qū)域內(nèi)的近紅外光譜。另一方面，從這些菌株的兩個片段序列從糞產(chǎn)堿菌的 S6（數(shù)據(jù)未顯示）的相同片段的同源性為 100％。相同的近紅外系統(tǒng)發(fā)育不同群體之間的類型的發(fā)生可能是由于硝化通過一個共同的祖先。由于細(xì)胞密度較高，從土壤等人群使用這些 PCR系統(tǒng)檢測應(yīng)盡可能 。 NIR之間同一物種不同類型的發(fā)生可能是水平基因轉(zhuǎn)移的指示。即使在糞產(chǎn)堿桿菌菌株，這兩種類型可以被檢測出來。nir 基因的保護程度是非常多變。這表明，這些 PCR 系統(tǒng)可能是一個更普遍的反硝化細(xì)菌檢測的合理手段。從每一個純文化測試，至少有兩個不同的引物組合成功應(yīng)用于 nirK 基因至少有三個成功應(yīng)用于近紅外光譜。使用這兩個基因的不同組合的引物和 PCR 方法在低溫的嚴(yán)格條件，近紅外片段的擴增，可以測試所有反硝化菌株。這兩個基因的保守區(qū)域不能被發(fā)現(xiàn)，因為酶的結(jié)構(gòu)不同。從三個 NIRS側(cè)翼一個保守的中部地區(qū) nirS基因序列的引物對純培養(yǎng)中的應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)比與抗血清的使用，但還不如利用基因探針令人滿意的反應(yīng)更廣泛。 nirS基因的不同擁有純培養(yǎng)更廣泛的響應(yīng)與抗血清相比，通過使用特定的基因探針。那么具體的反應(yīng)，可以得到組合血清對斯氏假單胞菌 JM300和綠膿桿菌（ hemetype dNirs。 rRNA基因定位探頭的使用已成功地應(yīng)用于迄今只有探索脫氮活性污泥法社會的菌株和特定群體。 AJ224902通過 AJ224913。C下 15分鐘 100毫升含 3 SSC和 ％（重量 /體積） SDS溶液的近紅外光譜。膜預(yù)雜交 2小時 20毫升辛易 HYB 解決方案（勃林格）在 42176。 DNA的交聯(lián)膜的紫外燈在 302納米（ 45秒）。電泳后，DNA被轉(zhuǎn)移到一個帶正電的尼龍膜樣品。分離出的產(chǎn)品是由鏈霉親和素酶聯(lián) 1鏈霉親和堿性磷酸共軛（ GATC）和 NBT / X磷酸鹽（勃林格，曼海姆，德國），由廠家指定的耦合分析的可視化。C 和 30秒引物退火和延伸，在 55176。直接測序的 PCR 產(chǎn)物純化循環(huán)測序試劑盒（的 GATC，康斯坦茨，德國）和 Thermosequenase （ Amersham公司， Braunschweig，德國），由廠家指定的 DNA 序列測定。C。每一個周期開始，在 45176。經(jīng)過 30個循環(huán)，最后 7分鐘的潛伏期為 72176。在PerkinElmer， Branchburg，新 澤西州）。從單純的文化和環(huán)境樣品進行PCR擴增量在 50毫升含 5 PCR緩沖液 103毫升（ 500毫米氯化鉀，氯化鎂 ， 25毫米200毫米的 TrisHCl [pH值 ， ％曲拉通 X100）的總 200毫米， Taq聚合酶鈾（ 5252。 Chelex 100（ 28）提取 DNA，并與 CTAB進一步純化。C 孵育 1小時的 SET 緩沖。由的 Smalla建議的修改由 Gliesche 等方法，在細(xì)胞裂解。C），細(xì)菌細(xì)胞從過濾器中刪除。哥廷根，德國）通過過濾去除顆粒大于 100毫米然后通過玻璃纖維過濾器（孔徑 3毫米 。C 10分鐘，沉淀空氣干燥和懸浮在 ％ NaCl溶液。C）和懸浮在 400毫升雙蒸水。N （石勒蘇益格 荷爾斯泰因州，德國） 100毫升。分光光度計的 DNA 制劑的純度和濃度測定。 Difco公司實驗室，底特律，密歇根州）種植，脫氮貧營養(yǎng)培養(yǎng)基上生長（ PYGV [25]）輔以 25‰ 的人工海水，蛋白胨酵母生