【正文】 ter, cells were harvested by centrifugation (6,000 3 g for 60 min at 4176。 Sigma Aldrich, Steinheim, Germany) precipitation step to remove humic acids and carbohydrates. Surface water (30 liters) from Lake Kleiner Plo168。 Millipore, Bedford, Mass.), and cells were collected on a Durapore filter (pore size, mm。C) and thawed (5 min at 30176。 DNA was extracted with Chelex 100 and further purified with CTAB . DNA from sediment (Lake Kleiner Plo168。C, a “touchdown” PCR was performed (Thermocycler 2400。C was performed. During the first 10 cycles, the annealing temperature was decreased by 176。C. The amplification products were analyzed by electrophoresis on 2% (wt/vol) agarose gels (Boehringer, Ingelheim, Germany) followed by a 15min staining with ethidium bromide ( mg liter21). Sequencing of amplified nir products. For DNA sequencing, amplified PCR products from pure cultures were purified with the QIAquick PCR purification kit (Qiagen, Hilden, Germany) as specified by the manufacturer. DNA sequences were determined by direct sequencing of purified PCR products with the cyclesequencing kit (GATC, Konstanz, Germany) and Thermosequenase (Amersham, Braunschweig, Germany) as specified by the manufacturers. Labeling was performed by terminating the polymerization with biotinlabeled dideoxynucleoside triphosphates. After a denaturing step of 4 min at 94176。C. The sequencing products were blotted with a direct blotting apparatus (GATC) onto a nylon membrane. The separated products were visualized by an enzymelinked streptavidinbiotin coupling assay with a streptavidinalkaline phosphatase conjugate(GATC)and NBT/Xphosphate (Boehringer, Mannheim, Germany) as specified by the manufacturers. The sequences obtained were pared with published nirK and nirS sequences in the EMBL Nucleotide Sequence Database by FASTA analysis of the HUSAR program package based on the Geics Computer Group sequence analysis package . Hybridization analysis of nir products from total DNA of environmental samples. Approximately 100 ng (pure cultures) or 250 ng (environmental samples) of PCR product was analyzed on an agarose gel (2%, wt/vol). After electrophoresis, the DNA was transferred onto a positively charged nylon membrane samples. Approximately 100 ng (pure cultures) or 250 ng (environmental samples) of PCR product was analyzed on an agarose gel (2%, wt/vol). After electrophoresis, the DNA was transferred onto a positively charged nylon membrane (QIAbrane Nylon Plus。C for nirK and 46176。已知的近紅外型硝化實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)可以得到證實(shí)。對(duì)于每個(gè)的兩個(gè)基因，成功擴(kuò)增引物組合至 少有一個(gè)為所有測(cè)試菌株。這是每個(gè) nir 基因在本研究開(kāi)發(fā)的水生生物棲息地的總 DNA 的一個(gè)普遍擴(kuò)增引物組合。它會(huì)導(dǎo)致在肥料應(yīng)用的主要農(nóng)業(yè)土壤的氮素?fù)p失。反硝化細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育多樣。催化亞硝酸鹽還原為 NO可以由兩個(gè)不同的亞硝酸鹽還原酶基因的產(chǎn)品：一個(gè)產(chǎn)品含有銅（ nirK基因產(chǎn)品），和其他含有色素 CD1（ NIRS產(chǎn)品）。 nirK 基因中只有 30％的反硝化細(xì)菌的研究迄今發(fā)現(xiàn)的。非常具體的檢測(cè)，主要是在應(yīng)變水平，可實(shí)現(xiàn)對(duì)異化硝酸鹽還原酶的血清（ dNirS ， 24，29和 dNirK ）。與一對(duì)引物，針對(duì) NIRS 亞硝酸鹽還原酶基因的 PCR 方法具有較高的特異性比雜交實(shí)驗(yàn)。 材料與方法 細(xì)菌的生長(zhǎng)條件。假單胞菌，產(chǎn)堿菌，副球菌，固氮螺菌菌株和反硝化隔離 IFAM 3698基因組 DNA的提取，增加營(yíng)養(yǎng)肉湯（ NB。紅假單胞菌 FSP?；蚪M DNA提取。 準(zhǔn)備從 5個(gè)樣品的 DNA。C 下厭氧條件下， 500毫升的濃縮再次接種和相同的生長(zhǎng)條件下保存。 168。 Sigma Aldrich公司， Steinheim，德國(guó)）沉淀步驟去除腐殖酸和碳水 化合物。 Millipore公司）。C）。C） 1冰鮮丙酮體積為 30分鐘，并保持在冰上。 集中由切向流過(guò)濾（ 31）從 10公升湖水湖 Plussee，石勒 蘇益格 荷爾斯泰因州，德國(guó)于 1996年 8月在 9米的深度收集細(xì)胞。收集在 1996年 4月），是由與一個(gè)額外的蛋白酶 K 處理方法（ 50毫升 20毫克 ML21解決方案），面包車(chē) Elsas 和 Smalla 分離后與 SDS 的潛伏期。 變性步驟 5分鐘后，在 95176。C間， 40秒一步的引物退火，延伸 40秒，在 72176。在第 10個(gè)循環(huán)，退火溫度降低 176。C。測(cè)序擴(kuò)增近紅外產(chǎn)品。經(jīng)過(guò) 4分鐘的變性步驟 94176。C。 從環(huán)境樣品總 DNA雜交分析，近紅外產(chǎn)品。電泳后， DNA被轉(zhuǎn)移到一個(gè)帶正電的尼龍膜（ QIAbrane尼龍加 。近紅外產(chǎn)品進(jìn)行純化，由生產(chǎn)廠(chǎng)家指定使用 QIAquick 凝膠提取試劑盒（ Qiagen）洗脫瓊脂糖凝膠帶。C 孵育過(guò)夜雜交經(jīng)過(guò)雜交，洗膜兩次，在室溫下在 5分鐘 100毫升含有 23 SSC（ 13 SSC是 M氯化鈉加檸檬酸鈉 ） ％（重量 /體積） SDS 和 45兩次的解決方案 176。核苷酸序列號(hào)。這里，我們描述了反硝化細(xì)菌檢測(cè)水生生物棲息地，由兩個(gè)截然不同的 PCR 系統(tǒng)使用的亞硝酸鹽還原酶基因， nirK基因和 NIRS的第一步。為此，亞硝酸鹽還原酶，其基因已被用于幾位作者，因?yàn)檫@是在反硝化過(guò)程中的關(guān)鍵酶。由于誘導(dǎo)性質(zhì)的酶，抗血清可檢測(cè)主動(dòng)脫硝的條件下非常有用。富集的文化，不同 人群的 denitri fiers 可檢測(cè)限制性?xún)?nèi)切酶消化籌備工作的總 DNA（酶切）與近紅外光譜探頭。這可能是因?yàn)?PCR 擴(kuò)增引物雜交區(qū)域的同源性是決定性的，而基因探針雜交，可以檢測(cè)，如果探頭任何地區(qū)，顯示出足夠的同源性。設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，兩側(cè)的兩個(gè)基因的高度保守的 C 端區(qū)域。發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)基因是在一個(gè)給定的應(yīng)變相互排斥，這是一致的。一般來(lái)說(shuō)，測(cè)序顯示，從底漆的雙 nirK1F nirK5R和nirS1FnirS6R 純文化的產(chǎn)品含銅和細(xì)胞色素 CD1含有亞硝酸鹽還原酶編碼基因的特異片段。在幀刪除或插入至 18基點(diǎn)，可觀察到測(cè)序區(qū)域內(nèi)的近紅外光譜。另一方面，從這些菌株的兩個(gè)片段序列從糞產(chǎn)堿菌的 S6（數(shù)據(jù)未顯示）的相同片段的同源性為 100％。相同的近紅外系統(tǒng)發(fā)育不同群體之間的類(lèi)型的發(fā)生可能是由于硝化通過(guò)一個(gè)共同的祖先。由于細(xì)胞密度較高，從土壤等人群使用這些 PCR系統(tǒng)檢測(cè)應(yīng)盡可能 。 NIR之間同一物種不同類(lèi)型的發(fā)生可能是水平基因轉(zhuǎn)移的指示。即使在糞產(chǎn)堿桿菌菌株，這兩種類(lèi)型可以被檢測(cè)出來(lái)。nir 基因的保護(hù)程度是非常多變。這表明，這些 PCR 系統(tǒng)可能是一個(gè)更普遍的反硝化細(xì)菌檢測(cè)的合理手段。從每一個(gè)純文化測(cè)試，至少有兩個(gè)不同的引物組合成功應(yīng)用于 nirK 基因至少有三個(gè)成功應(yīng)用于近紅外光譜。使用這兩個(gè)基因的不同組合的引物和 PCR 方法在低溫的嚴(yán)格條件，近紅外片段的擴(kuò)增，可以測(cè)試所有反硝化菌株。這兩個(gè)基因的保守區(qū)域不能被發(fā)現(xiàn)，因?yàn)槊傅慕Y(jié)構(gòu)不同。從三個(gè) NIRS側(cè)翼一個(gè)保守的中部地區(qū) nirS基因序列的引物對(duì)純培養(yǎng)中的應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)比與抗血清的使用，但還不如利用基因探針令人滿(mǎn)意的反應(yīng)更廣泛。 nirS基因的不同擁有純培養(yǎng)更廣泛的響應(yīng)與抗血清相比，通過(guò)使用特定的基因探針。那么具體的反應(yīng)，可以得到組合血清對(duì)斯氏假單胞菌 JM300和綠膿桿菌（ hemetype dNirs。 rRNA基因定位探頭的使用已成功地應(yīng)用于迄今只有探索脫氮活性污泥法社會(huì)的菌株和特定群體。 AJ224902通過(guò) AJ224913。C下 15分鐘 100毫升含 3 SSC和 ％（重量 /體積） SDS溶液的近紅外光譜。膜預(yù)雜交 2小時(shí) 20毫升辛易 HYB 解決方案（勃林格）在 42176。 DNA的交聯(lián)膜的紫外燈在 302納米（ 45秒）。電泳后，DNA被轉(zhuǎn)移到一個(gè)帶正電的尼龍膜樣品。分離出的產(chǎn)品是由鏈霉親和素酶聯(lián) 1鏈霉親和堿性磷酸共軛（ GATC）和 NBT / X磷酸鹽（勃林格，曼海姆，德國(guó)），由廠(chǎng)家指定的耦合分析的可視化。C 和 30秒引物退火和延伸，在 55176。直接測(cè)序的 PCR 產(chǎn)物純化循環(huán)測(cè)序試劑盒（的 GATC，康斯坦茨，德國(guó)）和 Thermosequenase （ Amersham公司， Braunschweig，德國(guó)），由廠(chǎng)家指定的 DNA 序列測(cè)定。C。每一個(gè)周期開(kāi)始，在 45176。經(jīng)過(guò) 30個(gè)循環(huán)，最后 7分鐘的潛伏期為 72176。在PerkinElmer， Branchburg，新 澤西州）。從單純的文化和環(huán)境樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增量在 50毫升含 5 PCR緩沖液 103毫升（ 500毫米氯化鉀，氯化鎂 ， 25毫米200毫米的 TrisHCl [pH值 ， ％曲拉通 X100）的總 200毫米， Taq聚合酶鈾（ 5252。 Chelex 100（ 28）提取 DNA，并與 CTAB進(jìn)一步純化。C 孵育 1小時(shí)的 SET 緩沖。由的 Smalla建議的修改由 Gliesche 等方法，在細(xì)胞裂解。C），細(xì)菌細(xì)胞從過(guò)濾器中刪除。哥廷根，德國(guó)）通過(guò)過(guò)濾去除顆粒大于 100毫米然后通過(guò)玻璃纖維過(guò)濾器（孔徑 3毫米 。C 10分鐘，沉淀空氣干燥和懸浮在 ％ NaCl溶液。C）和懸浮在 400毫升雙蒸水。N （石勒蘇益格 荷爾斯泰因州，德國(guó)） 100毫升。分光光度計(jì)的 DNA 制劑的純度和濃度測(cè)定。 Difco公司實(shí)驗(yàn)室，底特律，密歇根州）種植，脫氮貧營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)（ PYGV [25]）輔以 25‰ 的人工海水，蛋白胨酵母生