中國海洋大學(xué)基因工程l4第二章pcr技術(shù)(完整版)
【正文】 物延伸法 :檢測產(chǎn)物是否存在已知點突變 吸附后標(biāo)記的單核苷酸延伸 PCROLA（寡核苷酸連接實驗）：帶親合抗體產(chǎn)物與靶分子結(jié)合接近而被連接酶連接，從而與酶標(biāo)板上的抗原結(jié)合 ? 列出四種鑒定親緣關(guān)系或進(jìn)化關(guān)系的方法，原理 ? 若可得恐龍的 DNA ,如何通過 PCR和基因克隆檢測恐龍是溫血或變溫爬行動物 ? 列出四種鑒定親緣關(guān)系或進(jìn)化關(guān)系的方法，原理 ? rDNA、 RFLP、 RAPD、 SSR(ISSR)、 DNA fingerprinting ? 若可得恐龍的 DNA ,如何通過 PCR和基因克隆檢測恐龍是溫血或變溫爬行動物 ? 酶的克隆和表達(dá) 酶的熱穩(wěn)定性和最適溫度檢測和比較 溫血動物的范圍廣 復(fù)習(xí)提綱 什么是 PCR?其原理什么？ PCR反應(yīng)的典型過程怎樣？ PCR反應(yīng)中的引物設(shè)計有什么樣的原則？ 什么是熱啟動？ 用于 PCR的幾種 DNA 聚合酶有什么樣的特性？ PCR反應(yīng)中對金屬離子和模板的要求是什么？ 難于擴(kuò)增得到長片段產(chǎn)物的原因及其解決辦法。如果兩條不同大小的片段均被擴(kuò)增，可通過電泳分離，紫 外激發(fā)后可觀察到不同顏色的兩條帶。 ? X 10–7 X 10–6 ? 用于 PCR的 DNA聚合酶簡介 ? Vent DNA聚合酶具有 3’→5 ’的核酸外切酶活性和校正功能， 因此 ? 與其它 DNA聚合酶（如 Taq酶 ）相比，具有相對較好的高保真性，其 ? 出錯率為 X 10–5 X 10–5 ； ? Vent DNA聚合酶（ Thermococcus litoralis） ? 度小于 2 kb時，擴(kuò)增產(chǎn)物的長度與 Mg2+的濃度并無關(guān)聯(lián)； 如果擴(kuò)增長度大于 2 kb， 則需要高于 2 mM的 Mg2+，而在擴(kuò)增長 如果模板鏈中存在次黃嘌呤核苷或脫氧尿嘧啶核苷， Vent DNA ? 聚合酶不能延伸引物。 二、 原理 循環(huán) denature 94 ?C 30S annealing Tm5 ?C elongate 72 ?C cycle 2535 ? 三、 PCR反應(yīng)成分 ? 引物 (Primer): 1530nt ? 設(shè)計原則 ? *引物間 ACGC ? GAGC ? *引物內(nèi) AACTGTT ? *GC% ? *末端保守性 ? *兼并堿基 ? Taq酶 ? DNA聚合酶對 PCR精確性的重要影響 ? DNA聚合酶的保真性主要取決于其 3’→5’ 的核酸外切酶活性，它 ? 負(fù)責(zé)對錯誤摻入的堿基進(jìn)行校正。相關(guān)研究結(jié)果表明， DNA聚合酶的 ? 出錯率在每輪延伸每核苷酸 X 10–6 X 10–4范圍內(nèi)。 ? Mg2+ ? 模板 (Template) 制備和用量 ? 100bp~40kb 實際 3~5k ? 難于得到長擴(kuò)增產(chǎn)物的原因： ? *3’錯配 ? *高溫下脫嘌呤 (depurination)或脫嘧啶 (deamination)Taq不能通過 ? 100176。如果兩條被擴(kuò)增片段大小相同，電泳后可見一 條紅綠互補色 黃色帶。此時，擴(kuò)增產(chǎn)物無論大小，只要均被擴(kuò)增，就可見 一條紅綠互補的黃色條帶。雙聚合酶 消除錯配 ） or合成能力強酶 (Tth) ? *Tricine（三羥甲基甘胺酸） pH穩(wěn)定性 ? PCR buffer ? 、 KC
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