實驗二gstz基因的pcr擴增(編輯修改稿)
2025-03-20 23:35 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 以下公式幫助選擇合適的溫度： Tm值 (解鏈溫度 )=4(G+C)＋ 2(A+T) 復(fù)性溫度 =Tm值 (2～ 10℃ ) ? 在 Tm值允許范圍內(nèi)， 選擇較高的復(fù)性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結(jié)合，提高 PCR反應(yīng)的特異性。 ? 復(fù)性時間一般為 30～ 60sec，足以使引物與模板之間完全結(jié)合。 延伸溫度與時間 ? Taq DNA聚合酶的生物學(xué)活性： ? 70～ 80℃ 150核苷酸 /S/酶分子 ? 70℃ 60核苷酸 /S/酶分子 ? 55℃ 24核苷酸 /S/酶分子 ? PCR反應(yīng)的延伸溫度一般選擇在 70～ 75℃ 之間，常用溫度為 72℃ ，過高的延伸溫度不利于引物和模板的結(jié)合。 ? PCR延伸反應(yīng)的時間，可根據(jù)待擴增片段的長度而定，一般 1Kb以內(nèi)的 DNA片段，延伸時間 1min是足夠的。 3～ 4kb的靶序列需 3～ 4min；擴增 10Kb需延伸至 15min。延伸進間過長會導(dǎo)致非特異性擴增帶的出現(xiàn)。對低濃度模板的擴增，延伸時間要稍長些。 循環(huán)次數(shù) 循環(huán)次數(shù)決定 PCR擴增程度。PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度。一般的循環(huán)次數(shù)選在 30～ 40次之間，循環(huán)次數(shù)越多，非特異性產(chǎn)物的量亦隨之增多。 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40CycleΔRnThreshold 104 103 102 PCR PARAMETER ? Predenature: 94℃ 3min ? PCR Cycles: ? Denature 94 ℃ 30sec～ 1min ? Annealing Tm(2～ 10℃ ) 30sec～ 1min ? Extension 72 ℃ based on the length of amplicon ?Totally 3040 cycles ? Postextension:72 ℃ 7min PCR常見問題 ? 無擴增產(chǎn)物 ? 非特異性擴增 ? 拖尾 ? 假陽性 PCR常見問題之一 ? 無擴增產(chǎn)物 1. 模板 :含有抑制物，含量低 2. Buffer對樣品不合適 3. 引物設(shè)計不當(dāng)或者發(fā)生降解 4. 反應(yīng)條件： 退火溫度太高，延伸時間太短 原因 對 策 1. 純化模板或者使用試劑盒提取模板 DNA或加大模板的用量 2. 更換 Buffer或調(diào)整濃度 3. 重新設(shè)計引物（避免鏈間二聚體和鏈內(nèi)二級結(jié)構(gòu)）或者換一管新引物 4. 降低退火溫度、延長延伸時間 ?現(xiàn)象： 正對照有條帶 ， 而樣品則無 ； PCR常見問題之二 ? 非特異性擴增 ? 現(xiàn)象： PCR擴增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計的大小不一致 ， 或大或小 ， 或者同時出現(xiàn)特異性擴增帶與非特異性擴增帶 。 PCR常見問題之二 1. 引物特異性差 2. 模板或引物濃度過高 3. 酶量過多 4. Mg2+濃度偏高 5. 退火溫度偏低 6. 循環(huán)次數(shù)過多 原因 對 策 1. 重新設(shè)計引物或者使用巢式 PCR 2. 適當(dāng)降低模板或引物濃度 3. 適當(dāng)減少酶量 4. 降低鎂離子濃度 5. 適當(dāng)提高退火溫度或使用二階段溫度法 6. 減少循環(huán)次數(shù) ? 非特異性擴增 PCR常見問題之三 ? 拖尾 ? 現(xiàn)象： 產(chǎn)物在凝膠上呈Smear狀態(tài) 。 M 1 2 PCR常見問題之三 1. 模板不純 2. Buffer不合適 3. 退火溫度偏低 4. 酶量過多 5. dNTP、 Mg2+濃度偏高 6. 循環(huán)次數(shù)過多 原因 對 策 1
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