臨床基因擴增檢驗實驗室的規(guī)范化設(shè)置及其管理(編輯修改稿)
2024-09-01 01:52 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 小時以上可使RNA酶永久性失活。全血和骨髓標本必須進行抗凝處理。EDTA和枸櫞酸鹽是首選的抗凝劑。不能使用肝素抗凝，因為肝素是Taq酶的強抑制劑，而且在其后的核酸提取步驟中很難去除。臨床用于RNA(如HCV RNA)擴增檢測的血標本建議進行抗凝處理，并盡快(3小時以內(nèi))分離血漿，以避免RNA的降解。如未作抗凝處理，則抽血后，必須在1小時內(nèi)分離血清。(二)標本的穩(wěn)定化處理用于DNA擴增檢測的標本，采集后一般不需要特殊的穩(wěn)定化處理，但標本應(yīng)及時送至實驗室。由于RNA易受RNA酶的降解，因此用于RNA測定的標本有時必須進行穩(wěn)定化處理，如流行病學(xué)調(diào)查的現(xiàn)場采樣。異硫氰酸胍鹽(Guanidine thiocyanate,GITC)可使DNA酶和RNA酶立即失活，因此在采集標本時，可將標本材料如血清或血漿按1:4的比例加至含有5mol/L GITC的試管中，從而使血清(漿)中的RNA酶不可逆失活。經(jīng)上述穩(wěn)定化處理后，標本一般不需要冷藏即可郵寄。對于特定的檢測項目，上述穩(wěn)定化處理方法的效果究竟如何，要使用相應(yīng)的逆轉(zhuǎn)錄PCR測定方法來評價。(三)標本的運送 標本采集后必須盡快送至實驗室。經(jīng)過適當穩(wěn)定化處理的標本可在常溫下通過郵寄運送。如用于DNA擴增檢測的EDTA抗凝全血標本及用于RNA擴增檢測的經(jīng)GITC穩(wěn)定化處理的標本。通常在運送時，應(yīng)采用不易破碎的容器裝載標本。用于RNA檢測的標本，如果未經(jīng)穩(wěn)定化處理，則必須速凍后，放在干冰中運送。(四)標本的貯存臨床體液標本如血清/血漿等可于70℃下長時間貯存。用于DNA測定的已純化核酸樣本可在10mmol/L Tris1 mmol/L EDTA緩沖液(pH )中4℃保存。用于RNA測定的已純化核酸樣本應(yīng)在緩沖液中80℃或液氮中貯存。用乙醇沉淀的核酸樣本貯存在20℃即可。用GITC處理的RNA標本在室溫可保存7天。(五)標本的處理(核酸提取)標本處理即核酸提取純化是決定擴增檢測成敗的關(guān)鍵性步驟，在使用商品核酸提取試劑提取臨床標本中的核酸模板前，應(yīng)對其進行充分評價以驗證其提取的有效性。通常，核酸制備質(zhì)量不高是由于抑制物去除不完全所致，抑制物可能來源于標本本身(如血紅素及其前體或降解產(chǎn)物)或核酸提取過程中殘留的有機溶劑(如酚、氯仿等)，這些物質(zhì)對其后的 Taq酶擴增反應(yīng)步驟具有強烈的抑制作用，從而影響靶核酸的擴增測定。當標本為痰時，則必須先進行液化處理，再提取核酸。需注意的是，液化時不能加熱，液化時間不能過長。此外，當靶核酸為RNA時，逆轉(zhuǎn)錄PCR測定失敗的常見原因是標本在運送前未經(jīng)充分的穩(wěn)定化處理及核酸提取試劑的RNA酶的污染。對于前者，要核查測定分析前的步驟，如果發(fā)現(xiàn)有RNA降解的證據(jù)，實驗室則應(yīng)拒絕接受標本，要求重新采取標本，并對運送者給以詳細的指導(dǎo)。對于后者，建議使用高質(zhì)量的商品核酸提取試劑。(六)靶核酸的逆轉(zhuǎn)錄(RT)和擴增靶RNA的逆轉(zhuǎn)錄 cDNA合成為逆轉(zhuǎn)錄PCR中的第一個酶反應(yīng)步驟，所產(chǎn)生的cDNA為靶RNA的反向互補鏈，為后面擴增的模板。下述因素通常影響cDNA合成的效率：(1)逆轉(zhuǎn)錄效率的降低或完全缺乏。其可能的原因有逆轉(zhuǎn)錄酶質(zhì)量不高、試劑降解變質(zhì)或加樣錯誤等。(2)用于逆轉(zhuǎn)錄的標本中存在逆轉(zhuǎn)錄或Taq酶的抑制物(如酚、氯仿、血紅素等)。(3)RNA酶的存在導(dǎo)致RNA的降解。 核酸的擴增有多種因素可引起核酸擴增檢測的假陽性或假陰性結(jié)果，如擴增靶核酸中抑制劑存在、Taq酶失活、退火溫度不對、Mg++濃度不佳、患者標本或試劑受污染等。擴增儀孔中熱傳導(dǎo)的均一性極為重要，必須定期對擴增儀的溫度控制和加熱模塊中熱傳導(dǎo)的一致性進行檢查，以避免假陰性結(jié)果。(七)污染在實際工作中，常見有以下幾種污染類型：擴增片段的污染(產(chǎn)物污染)。天然基因組DNA的污染、試劑污染(貯存液或工作
環(huán)評公示相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號-1