【正文】 94oC, 45 sec 55oC, 1 min 72oC, 2 min ? 退火溫度的變化是根據(jù)引物的 GC比例 、 引物的長(zhǎng)度 調(diào)整的。 Annealing From 45oC to 60oC. Usually it is around 55℃ for 1 min. 退火 溫度與引物序列關(guān)系非常密切 ， 退火時(shí)間與引物長(zhǎng)度和 GC含量有關(guān) 。 引物長(zhǎng)度一般在 1525bp之間 。 Tm=4(G+C)+2(A+T) (a) Annealing temperature is too high Primers and templates remain dissociated. (b) Annealing temperature is too low. Mismatched hybrid. (c) Correct annealing temperature. Priming occures only at the desired target sites. How to decide annealing temperature? (a) (b) (c) 溫度越高，特異性 (specificity)越高。 溫度： 72℃ ， 74℃ ，是 Taq 酶的最適工作溫度。 時(shí)間：根據(jù)待擴(kuò)增基因片段的大小確定延伸時(shí)間。 過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)物非特異性增加。 酶的 延伸效率： 1000bp/1min。 小于 500bp，一般采用 1分鐘即可； 500~2022bp: 2 min。 超過(guò) 2022bp， 一般可適當(dāng)延長(zhǎng)延伸時(shí)間 ， 3分鐘 。 ? 4）延伸溫度和時(shí)間 ?典型的 PCR條件： ?94～ 95℃ 30S ， 55℃ 1min ， 72℃ 2min 25～ 30個(gè) cycles后 72℃ 延伸 10min。 循環(huán)次數(shù)： 25～ 30cycles 循環(huán)過(guò)多會(huì)增加堿基的錯(cuò)配幾率。 ? 4） 循環(huán)次數(shù) 總結(jié)： 其他因素 1）熱啟動(dòng)：提高擴(kuò)增的特異性 2）添加劑： DMSO消除引物與模板的二級(jí)結(jié)構(gòu)，降低 DNA的解鏈溫度，增進(jìn) DNA復(fù)性時(shí)的特異配對(duì)。 3）液體石蠟：防止反應(yīng)液蒸發(fā)后反應(yīng)成分的改變。 How big is a target DNA? ? typically in the size range 1001500 bp. ? Longer targets are amplifiable — 25 kb. ? Requires modified reaction buffer, cocktails of polymerases, and longer extension times. 五、 常見(jiàn)問(wèn)題與對(duì)策 PCR常見(jiàn)問(wèn)題之一 ? 無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物 假陰性 1. 模板 : ① 提取的模板核酸中含有雜蛋白質(zhì)、 酚、 EDTA等抑制了 Taq酶活性 ② too much or too little 原因 ： ①選一個(gè)好的引物合成單位。 ② 引物的濃度不僅要看 OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳， 兩引物帶的亮度應(yīng)大體一致 ，如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時(shí)要平衡其濃度。 ③ 引物發(fā)生降解 : 引物應(yīng)高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長(zhǎng)期放 4 ℃ 導(dǎo)致引物變質(zhì)降解失效。 ④引物設(shè)計(jì)不當(dāng) : 引物設(shè)計(jì)不合理，如引物長(zhǎng)度不夠，引物之間形成二聚體等。 Mg2+濃度： 濃度過(guò)高可降低 PCR擴(kuò)增的特異性， 濃度過(guò)低則影響 PCR擴(kuò)增產(chǎn)量 , 甚至不出擴(kuò)增條帶。 酶失活： ①酶的失活， ② PCR時(shí)忘了加 Taq酶。 變性不徹底： 變性溫度低，變性時(shí)間短。 退火溫度太高，延伸時(shí)間太短 PCR儀溫度的準(zhǔn)確性。 設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照 假陰性 PCR常見(jiàn)問(wèn)題之二 ? 假陽(yáng)性 現(xiàn)象： 空白對(duì)照出現(xiàn)目的擴(kuò)增產(chǎn)物 PCR污染原因 ? 實(shí)驗(yàn)室中克隆質(zhì)粒的污染 、 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物污染 ? 實(shí)驗(yàn)室中加樣槍、白大衣、 PCR試劑的污染 ? 實(shí)驗(yàn)室中氣溶膠污染 ? 標(biāo)本間交叉污染 PCR污染： 極微量的污染便可導(dǎo)致假陽(yáng)性 1) 打開(kāi)離心管前 應(yīng)先離心，將管壁及管蓋上的液體甩至管底部。 開(kāi)管動(dòng)作要輕，以防管內(nèi)液體濺出， 防止將 靶序列 濺出離心管外，防止將 靶序列 吸入加樣槍內(nèi) ，造成實(shí)驗(yàn)室污染 ； 2) 除了 酶等 不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑器材均高壓消毒。 手套、 離心管及槍頭 (質(zhì)量好） 等一次性使用 ,不要 碰到別處 。 必要時(shí)，在加標(biāo)本前，反應(yīng)管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。 3) 各種試劑先進(jìn)行分裝，低溫貯存。 防止污染的方法 ? 合理分隔實(shí)驗(yàn)室 隔離的專用操作區(qū)、專用加樣器 ① 標(biāo)本處理區(qū) 。 ② PCR反應(yīng)液制備區(qū) 。 ③ PCR循環(huán)擴(kuò)增區(qū) 。 ④ PCR產(chǎn)物鑒定區(qū) . 陰性對(duì)照 ? 試劑 對(duì)照 :在 PCR試劑中不加模板 DNA或 RNA，進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，以監(jiān)測(cè)試劑是否 污染 設(shè)立適當(dāng)?shù)膶?duì)照 ? 標(biāo)本對(duì)照 :被檢的標(biāo)本是血清就用 鑒定后的正常血清作對(duì)照 。被檢的標(biāo)本是組織細(xì)胞就用相應(yīng)的組織細(xì)胞作對(duì)照 PCR常見(jiàn)問(wèn)題之三 ? 非特異性擴(kuò)增 現(xiàn)象： 1） PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致； 2） 或者同時(shí)出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶與非特異性擴(kuò)增帶 。 1) 引物特異性差 , 引物與靶序列不完全互補(bǔ)、或形成引物二聚體。 其對(duì)策 : 必要時(shí)，重新設(shè)計(jì)引物。 2) 模板或引物濃度過(guò)高 3) 酶量過(guò)多或質(zhì)量不好 4) Mg2+濃度偏高 5) 退火溫度偏低 6) 循環(huán)次數(shù)過(guò)多 原因 ? 非特異性擴(kuò)增 PCR常見(jiàn)問(wèn)題之四 ? 拖尾 ? 現(xiàn)象： 產(chǎn)物在凝膠上呈 Smear狀態(tài) M 1 2 1) 模板不純或降解 2) Buffer不合適 3) 退火溫度偏低 4) 酶量過(guò)多或質(zhì)量差 5) dNTP、 Mg2+濃度偏高 6) 循環(huán)次數(shù)過(guò)多 原因 ? 拖尾 如果是在低分子量部分有 smear, 可能是引物dimer,應(yīng)當(dāng)減少引物量，或更換引物。 如果是在高分子量部分有 smear, 可能是高分子的 DNA模板，應(yīng)減少模板量，或減少循環(huán)數(shù)。 六、 PCR的應(yīng)用 ? 研究 基因克隆， DNA測(cè)序，分析突變 ? 診斷 細(xì)菌、病毒、寄生蟲(chóng)檢測(cè)，診斷 ? 腫瘤 各種腫瘤檢測(cè) ? 人類基因組工程 遺傳圖譜的構(gòu)建， DNA測(cè)序，表達(dá)圖譜 ? 法醫(yī) 犯罪現(xiàn)場(chǎng)標(biāo)本分析 ? 其他 ……