dna抽取和質(zhì)粒dna制備-資料下載頁
2025-01-17 05:49本頁面
【正文】 e)：胍鹽是破壞蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的離液劑。 ? 蛋白質(zhì)變性劑中作用最強的是異硫氰酸胍和鹽酸胍，使蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換成隨機卷曲狀態(tài)。 ? 鹽酸胍抑制 RNA酶作用強，變性作用較異硫氰酸胍弱。異硫氰酸胍自身可形成氫鍵，在還原劑存在下斷裂氫鍵。 ? 聯(lián)合使用 RNase的特異抑制劑 （ 如 RNasin與DEPC等 ） 能極大地防止內(nèi)源性 RNase對 RNA的降解 。 (RNase inhibitor) （ 1） DEPC（ 焦碳酸二乙酯） ? 高度活化的烷基化試劑，破壞 RNA酶活性。用來滅活緩沖液或器皿中的 RNA酶。 O CCH2CH3 O CCH2CH3 O = = DEPC水制備： %DEPC在 37176。 C處理 1h， 并高壓滅菌 15min。 玻璃制品和塑料制品應(yīng)浸泡在 %的 DEPC水溶液中， 37176。 C處理 1h或室溫下過夜。 DEPC非選擇性的修飾蛋白質(zhì)和 RNA， 且與一些緩沖液不相容，故在分離和純化 RNA的過程中不使用 DEPC。 （ 2） RNA酶的蛋白抑制劑 ? 許多 RNA酶可以與該類蛋白質(zhì)結(jié)合形成非共價復(fù)合物從而是 RNA酶失活。 ? RNA酶蛋白抑制劑與靶蛋白的親和力大。 ? 商品化的 RNA酶蛋白抑制劑的名稱各異（如 RNAsin等）。 ? 加入 β 疏基乙醇 、 二硫蘇糖醇 （ DTT） 等還原劑可以還原 RNase中的二硫鍵 ， 有利于RNase的變性 、 水解與滅活 。 RNA提取實驗前的準(zhǔn)備 【 使用器具 】 盡量使用一次性塑料器皿，若使用玻璃器皿，則使用%DEPC水溶液在 37℃ 處理 12h，后 120℃ 高壓 30min，去除殘留 DEPC 【 試劑配制 】 無菌水須用 %DEPC處理后高溫高壓滅菌 RNA實驗試劑應(yīng) RNA提取專用，避免其他試劑交叉污染 【 其他 】 實驗過程中使用一次性手套，并經(jīng)常更換；在 RNA專用區(qū)操作，操作過程中避免交談 … … 三、酸性異硫氰酸胍 酚 氯仿一步法 ? 首先以含異硫氰酸胍 、 β 疏基乙醇和十二烷基肌氨酸鈉的變性溶液裂解細(xì)胞 。 ? 然后在 ， 酚 /氯仿抽提細(xì)胞裂解溶液 。 ? 最后通過異丙醇沉淀與 75%的乙醇洗滌而獲得總 RNA。 ? 本法具有簡便 、 快速 、 經(jīng)濟 、 高效及提取的 RNA質(zhì)量高等優(yōu)點 ， 能在 3小時內(nèi)迅速處理多個標(biāo)本 。 ? 總 RNA產(chǎn)量取決于標(biāo)本的起始量 ， 每 mg組織大約能制備 4～ 7181。g總 RNA， 每 106個細(xì)胞大約為 4～ 10181。g。 四、商品化的單相裂解試劑法分 RNA ? 本法是異硫氰酸胍 酚 氯仿一步法的改進(jìn)方案 。 ? 以異硫氰酸胍 酚的單相裂解液裂解細(xì)胞 ， 再加入氯仿后形成兩相 。 ? 變性的 DNA與蛋白質(zhì)介于兩相的交界面 ， 可使用乙醇和異丙醇分級沉淀出來 。 ? 保留于上層水相的 RNA， 通過異丙醇沉淀與 75%乙醇洗滌而制備 。 四、商品化的單相裂解試劑法分 RNA ? 目前 ， 該法已成為實驗室最常用的總 RNA提取法 ， 其產(chǎn)量及質(zhì)量與前法相當(dāng) 。 Trizol 五、 mRNA的分離純化 ? 除血紅蛋白及組蛋白的 mRNA外 ， 絕大多數(shù) mRNA在其3180。末端帶有長短不同的 poly（ A） 尾巴 。 ? 利用堿基配對原則 ， 通過 oligo（ dT） 纖維素或poly（ U） 瓊脂糖凝膠的親和層析 ， 可以很容易地從總 RNA制品中分離純化 mRNA。 1. oligo（ dT） 纖維素柱層析法 2. oligo（ dT） 纖維素柱離心法 3. oligo（ dT） 纖維素液相結(jié)合離心法 4. 磁性球珠分離法 （ 1） oligo(dT)纖維素層析柱法 （ 2） oligo(dT)纖維素液相結(jié)合離心法 （ 3）磁珠分離法 實驗步驟 1 每 mg組織中加入 1mlTrizol試劑，高速破碎組織（使用高速組織搗碎器） 2 加入氯仿 ,輕輕顛倒混勻，室溫靜置分層。 3. 高速離心 12022rpm， 48 176。 C ， 10分鐘 ，約 600ul 5 加入 500ul異丙醇，混勻，室溫靜置 10分鐘 12022rpm， 48 176。 C ， 10分鐘 ，沉淀為 RNA 1mlDEPC處理的 75%乙醇，混勻，7500rpm離心， 48176。 C， 5分鐘 DEPC處理水 30ul， 混勻， 5560 176。 C水浴 297ulDEPC水，測定濃度和純度 RNA濃度（ μg /ml） =A260 40 1/光徑 稀釋倍數(shù) RNA純度 =A260/A280 比值為 RNA較純 RNA鑒定 ? 濃度鑒定 ? 紫外吸光光度法 : A260 稀釋倍數(shù) 40＝ μg/ml (OD260OD320) 稀釋倍數(shù) 40＝ μg/ml ? 純度鑒定 ? OD260/OD280 (~) Ratio : 蛋白質(zhì)污染 Ratio : RNA可能已經(jīng)水解成單核苷酸 注：測定吸光值，稀釋液應(yīng)使用ＴＥ 正常時， 28S RNA的熒光強度約為 18S RNA的2倍，否則提示RNA的降解 完整性鑒定： ? 如何避免ＲＮＡ含量較低？ ? ＯＤ２６０／ＯＤ２８０ １ .６５時可能存在的問題？ 核酸的貯存 —— RNA保存 ? RNA可溶于 ，在 70℃ 保存。 ? RNA可溶于 70%的乙醇溶液或去離子的甲酰胺溶液中，可在 20 ℃ 保存。 ? RNA如果以 DEPC（ 焦碳酸二乙酯）可以抑制 RNA酶對 RNA的降解
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