dna重組質(zhì)粒的構(gòu)建概述-資料下載頁(yè)
2025-01-08 02:37本頁(yè)面
【正文】 使用限制性內(nèi)切酶的一般步驟A）測(cè)試酶切 DNA的量B）計(jì)算完全酶切所需的酶量。為使終體積中甘油的濃度低于 8%，計(jì)算能加的酶量，最多能加終體積的10%（甘油的濃度為 5%）。C） 10X反應(yīng)液的體積應(yīng)為終體積的 1/10； 10X反應(yīng)液的體積不應(yīng)小于酶的體積。D）加入計(jì)算好的 DNA， 10X反應(yīng)液，酶。加入水到終體積（ 2050 ul），輕輕混勻，在適當(dāng)?shù)臏囟认卤?。一般酶的最適溫度為 37 oC，但有例外。應(yīng)查訊分析說(shuō)明。舉例質(zhì)粒 DNA （ 2ug/ ul） 5 ul10X反應(yīng)液 5 ul內(nèi)切酶 2uldH2O 38 ul總體積 50 ul37 oC保溫 23小時(shí)。應(yīng)最后加酶。提高限制性核酸內(nèi)切酶對(duì)低純度 DNA制劑的反應(yīng)效率，可采用的方法v增加限制性核酸內(nèi)切酶的用量，平均每微克底物 DNA可高達(dá) 10個(gè)活性單位甚至更多些。v擴(kuò)大酶催化反應(yīng)的體積，使?jié)撛诘囊种埔蛩乇幌鄳?yīng)的稀釋。v延長(zhǎng)酶催化反應(yīng)的保溫時(shí)間。能否在一次反應(yīng)中用很多的限制性內(nèi)切酶？ 可以，一般而言，甘油濃度超過(guò) 8%對(duì)酶切有抑制。有些酶在高的甘油濃度中會(huì)產(chǎn)生星號(hào)活力。限制性內(nèi)切酶提供在 50%的甘油中，故 10 ul反應(yīng)體積中不應(yīng)加入超過(guò) ul的酶。： 根據(jù)重組的需要，有時(shí)需要用雙酶切（單酶切：由于只有一種酶切，載體片段很容易相互粘連，形成空載體），這樣重組效果會(huì)更好。 雙酶切時(shí)要先分析兩種酶且的條件，根據(jù)兩種酶切的緩沖液要求，有三種情況兼 容 性 處 理完全兼容 同時(shí)加 2種酶進(jìn)行酶切完全不兼容 先用一種酶切，沉淀洗鹽，再用另一種酶切相對(duì)兼容 （其中一種酶活性相對(duì)較低）同時(shí)加 2種酶進(jìn)行酶切只是鹽離子濃度不同先用低離子要求的酶切，再補(bǔ)加酶和鹽。：酶切條件與外源 DNA沒(méi)有區(qū)別。載體多位環(huán)狀 DNA,如果只有一個(gè)酶切位點(diǎn)，用單酶切。目前商業(yè)化載體均有多克隆位點(diǎn)，含有多個(gè)酶切位點(diǎn)，可以進(jìn)行多種選擇和取舍。酶切產(chǎn)物回收離心柱回收純化酶切產(chǎn)物 DNA片段純化問(wèn)題：純化 PCR產(chǎn)物割膠還是柱式，推薦柱式，因?yàn)楦钅z手法不準(zhǔn)，很容易割下大塊的膠，影響純化效率。現(xiàn)在的柱式純化號(hào)稱可以祛除引物，既然如此，酶切掉的幾個(gè)堿基肯定也會(huì)被純化掉了。所以， PCR產(chǎn)物和雙酶切產(chǎn)物的純化均可應(yīng)用柱式純化。數(shù)據(jù)庫(kù) 限制性內(nèi)切酶的數(shù)據(jù)庫(kù) 其中含有已知的所有限制性內(nèi)切酶的完整表，包括識(shí)別的序列，甲基化的敏感性，商業(yè)信息和參考文獻(xiàn)。Company: TAKARA Fermentas 連接酶（ ligase)v主要有兩種： T4噬菌體 DNA連接酶和大腸桿菌DNA連接酶。催化相鄰 DNA鏈的 5’P 和 3’OH末端以磷酸二酯鍵結(jié)合。 E. coli DNA 連接酶催化 DNA分子連接的機(jī)理與 T4噬菌體 DNA連接酶基本相同，只是輔助因子不是 ATP而是NAD+。 T4噬菌體 DNA連接酶還有一種 E. coli DNA連接酶沒(méi)有的特性即將兩個(gè)平末端的雙鏈 DNA分子連接起來(lái)的功能。對(duì)于這種連接反應(yīng)的機(jī)理目前還不清楚，總的來(lái)說(shuō)這種連接的效率比粘性末端的連接效率要低得多，可能是因?yàn)槠侥┒?DNA分子無(wú)法形成類似粘性末端分子那樣的相對(duì)穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。1. Weiss單位（ Weiss等 ,1968），是指在 37oC下 20分鐘內(nèi)催化 1nM 32P從焦磷酸根置換到 [?,?32P] ATP所需酶量；2. （ NEB公司，粘性末端）將 1?g由 HindIII酶解的?DNA的 12堿基對(duì)粘性末端在 160C條件下、 30分鐘、 20?l反應(yīng)體系中連接 50?時(shí)所需酶量。3. (Takara公司 )在 20?l的反應(yīng)體系中， 6?g的 ?DNAHindIII的分解物在 160C反應(yīng) 30分鐘時(shí)，有 90?以上的 DNA片段進(jìn)行連接的酶的活性為 1U。 相當(dāng)于 ATPPpi交換反應(yīng)中 Weiss U。對(duì)于 T4噬菌體 DNA連接酶的活性測(cè)定至少有三種以上的方法：DNA重組 —— 連接DNA的連接主要有粘性末端和平端連接法，這些主要根據(jù)外源片段的末端性質(zhì)、質(zhì)粒性質(zhì)以及兩者的酶切位點(diǎn)來(lái)確定。 相同末端：直接將外源 DNA和載體片段加在一起，進(jìn)行連接；不同末端：需要將外源 DNA和載體 DNA的末端調(diào)整成一致。多數(shù)情況是變成平末端，這可通過(guò) DNA酶降解，或 DNA聚合酶不平的方式解決。單酶切：由于只有一種酶切，載體片段很容易相互粘連，形成空載體，通常用去磷酸化的方法以避免。對(duì)于表達(dá)載體構(gòu)建時(shí)，還需識(shí)別其方向。雙酶切：直接連接，并且方向是確定的，所以選擇這一方案時(shí)，要考慮其方向性。連接反應(yīng)的一項(xiàng)重要參數(shù)是溫度。理論上講連接反應(yīng)的最佳溫度是 37℃ ，此時(shí)連接酶的活性最高。但 37℃ 時(shí)粘性末端分子形成的配對(duì)結(jié)構(gòu)極不穩(wěn)定，因此人們找到了一個(gè)既可最大限度地發(fā)揮連接酶的活性，又有助于短暫配對(duì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的最適溫度即12~16℃ 。DNA的連接主要有粘性末端和平端連接法，這些主要根據(jù)外源片段的末端性質(zhì)、質(zhì)粒性質(zhì)以及兩者的酶切位點(diǎn)來(lái)確定。 一般外源片段較載體摩爾濃度高 ， 5： 1。有的加入聚乙二醇?？墒狗磻?yīng)速度加快。連接反應(yīng)：H2O 補(bǔ)充使總體 10ulATP（含在 buffer 中） 10XBuffer 1ul外源 DNA 1ul載體 DNA 34ulT4DNA連接酶 1ul 外源基因與載體的連接粘性末端連接演講完畢，謝謝觀看！
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