dna重組技術(shù)的基本過(guò)程-資料下載頁(yè)
2025-01-08 01:54本頁(yè)面
【正文】 要研究或應(yīng)用的基因，也就是將要克隆或表達(dá)的基因或基因的一個(gè)片段。獲取目的基因是分子克隆中最重要的一步。（一）目的基因制備的目的1. 克隆特定的基因或 cDNA；2. 構(gòu)建克隆或表達(dá)載體；3. 構(gòu)建基因文庫(kù)：基因組 DNA文庫(kù)和 cDNA文庫(kù)第四節(jié) 重組 DNA技術(shù)的基本過(guò)程 （二）目的基因常用的制備方法 （ 1）從原核基因組 DNA制備－視基因組物理圖譜已知或未知，克隆方法不同。（ 2）從真核基因組 DNA制備－染色體步移法（ chromosome walking）。（ 3）從已克隆的 DNA片段制備－直接酶切回收2. PCR或 RT/PCR方法制備目的基因（ 1） 獲取已知基因（ 2） 構(gòu)建 RT/PCR文庫(kù)法獲取未知基因： 即利用 GenBank信息，利用不同種屬同源性設(shè)計(jì)引物，嘗試獲取未知基因片段，這有賴于各種計(jì)算機(jī)軟件的應(yīng)用。： 制備基因片段－用 DNA合成儀，對(duì)目的基因分段合成，連接，可以得到所需的目的基因。三、 DNA片斷的重組連接 目的基因和載體 DNA是重組的基本構(gòu)件， DNA片斷的重組連接是目的基因與載體的連接。 獲得目的基因后必須將其放在一定的載體上才能進(jìn)入宿主細(xì)胞擴(kuò)增或表達(dá)。習(xí)慣上將目的基因與載體連接及其后續(xù)的轉(zhuǎn)化過(guò)程稱為 克隆 ， 可能是目的基因＋載體形成一個(gè)新的 DNA重組分子（新的genotype），后者必然會(huì)產(chǎn)生一個(gè)新的菌體克?。?phenotype）。 限制酶剪切或機(jī)械剪切目的基因或載體可以產(chǎn)生粘端和平端的DNA分子。催化二者重組連接（粘端或平端）反應(yīng)的酶常用 T4DNA ligase。四、重組 DNA（ rDNA）導(dǎo)入受體細(xì)胞（一）導(dǎo)入目的 克隆擴(kuò)增克隆表達(dá)受體細(xì)胞（ 1）原核細(xì)胞 既可以復(fù)制擴(kuò)增，也可以基因表達(dá)。（ 2）真核細(xì)胞 一般只用作基因表達(dá)系統(tǒng)。（二）受體細(xì)胞的基本條件 易接納 rDNA分子；對(duì)載體復(fù)制擴(kuò)增無(wú)嚴(yán)格限制；不降解；不修飾外源 DNA分子。（三）轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)染 （ transformation/transfection） rDNA導(dǎo)入原核細(xì)胞的過(guò)程稱轉(zhuǎn)化，導(dǎo)入真核稱轉(zhuǎn)染。（四） rDNA導(dǎo)入受體細(xì)胞方法舉例方法方法 原理概要原理概要 備注備注1. 重組質(zhì)粒重組質(zhì)粒DNA導(dǎo)入導(dǎo)入 (1) 低溫低溫 CaCl2（冰?。┨幚恚ū。┨幚?Ecoli，使成，使成 為感受態(tài)細(xì)胞。為感受態(tài)細(xì)胞。 (2)rDNA與受體菌混合－與受體菌混合－ 冰?。。?42℃℃ 熱熱休克－休克－ 即可使即可使 rDNA進(jìn)入進(jìn)入 Ecoli。 (3) 接種于含抗生素平皿中轉(zhuǎn)化－接種于含抗生素平皿中轉(zhuǎn)化－ 篩選篩選（（ 1）） pent cells具有攝取具有攝取外源外源 DNA能力的細(xì)胞。能力的細(xì)胞。（（ 2）高頻電流電穿孔法（）高頻電流電穿孔法（elecroporation）能使外源）能使外源DNA進(jìn)入進(jìn)入 Ecoli。2. λphage－－rDNA分子導(dǎo)入分子導(dǎo)入Ecoli(1)包裝包裝 使使 λphageDNA重組重組 DNA獲得感染獲得感染E. coli能力能力(2)接種合適的平皿上進(jìn)行培養(yǎng)，溶菌生長(zhǎng)接種合適的平皿上進(jìn)行培養(yǎng)，溶菌生長(zhǎng)皿上可見(jiàn)清亮的噬菌斑，溶源有一部溶菌皿上可見(jiàn)清亮的噬菌斑，溶源有一部溶菌，溶菌斑是混濁的，溶菌斑是混濁的(1)λ噬菌體感染噬菌體感染 E. coli只注入只注入核酸核酸(2)含含 λ噬菌體頭、尾部蛋白已噬菌體頭、尾部蛋白已商品化，包裝商品化，包裝 rDNA使之獲得使之獲得感染感染 E. coli能力能力(3)溶菌：產(chǎn)生子代溶菌：產(chǎn)生子代 λ噬菌體；噬菌體；溶源：不產(chǎn)生子代。溶源：不產(chǎn)生子代。 E coli(1)酶切酶切 cosmid和部分真核和部分真核 DNA并連接二者并連接二者成成 rDNA(2)包裝噬菌體成噬菌體顆粒感染包裝噬菌體成噬菌體顆粒感染 E. coli(3)用抗生素抗性標(biāo)記篩選用抗生素抗性標(biāo)記篩選 rDNA噬菌體噬菌體 2個(gè)尾巴＋質(zhì)粒即個(gè)尾巴＋質(zhì)粒即cosmid（粘尾質(zhì)粒）。（粘尾質(zhì)粒）。五、轉(zhuǎn)化菌的篩選（一） λ噬菌感染 E. coli可以溶菌生長(zhǎng)，形成很亮的噬菌斑， 溶源生長(zhǎng)多少也有溶菌，形成噬菌斑挑選噬菌斑即可分析鑒定轉(zhuǎn)化子。 （二）質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 E. coli， 可用含抗生素的平板篩選，挑選陽(yáng)性克隆分析鑒定轉(zhuǎn)化子。六、 DNA重組體的篩選 轉(zhuǎn)化子不一定就是重組子。（一） α－互補(bǔ)： 藍(lán)白菌落篩選或稱 Xgal篩選（二） 插入失活： 適用于帶有抗生素抗性標(biāo)記基因的克隆載體（ 三） 雜交篩選（四）質(zhì)粒小量快速提取加酶切鑒定 乳糖操縱子的天然誘導(dǎo)物是乳糖。乳糖類似物異丙基 βD 硫代半乳糖苷（ IPTG）有更強(qiáng)的誘導(dǎo)作用。 IPTG配合使用在基因工程可作藍(lán)白斑篩選。 LacZ基因編碼的乳糖苷酶 Xgal 藍(lán)色吲哚產(chǎn)物(5溴 4氯 3吲哚 αD半乳糖苷 ) 藍(lán)白斑試驗(yàn)（ IPTG,Xgal 試驗(yàn) ）XgalLac Z藍(lán)色化合物Xgal（ LacZ基因 N端序列） 插入片段（ LacZ基因失活）LacZ基因 N端序列LacZ酶pUC19APCAI和 pBR325APOAI質(zhì)粒 PNA及其 EcoRI酶切產(chǎn)物的瓊脂糖電泳圖EcoRIpBR325APOAIpUC19APOAI加樣孔 pUC19方法方法 優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn) 缺點(diǎn)缺點(diǎn) 選擇順序選擇順序 互補(bǔ)互補(bǔ) 簡(jiǎn)潔而行簡(jiǎn)潔而行 試劑貴試劑貴 ,受材料限制受材料限制 有錢首選有錢首選 方便易行方便易行 費(fèi)時(shí)費(fèi)力費(fèi)時(shí)費(fèi)力 無(wú)錢首選無(wú)錢首選 易行易行 受材料局限受材料局限 可選可選 經(jīng)典靈敏經(jīng)典靈敏 放標(biāo)放標(biāo) /非放標(biāo)非放標(biāo) 可選可選四種 DNA重組子篩選方法的比較 七、 DNA重組體的鑒定 外源 DNA片斷是否插入載體構(gòu)成重組 DNA分子，而插入片斷大小 ,是否突變及插入位置 ,順序及方向則關(guān)系到構(gòu)建載體是否擴(kuò)增 ,我們所需要的基因或表達(dá) ,表達(dá)相應(yīng)的產(chǎn)品 .所以需要進(jìn)一步鑒定 DNA重組體。（一）酶切鑒定是必需的（二）若構(gòu)建 DNA重組體是為了克隆某個(gè)基因 ,可進(jìn)行在序列測(cè)定。（三）若構(gòu)建表達(dá)載體 ,可進(jìn)行表達(dá)產(chǎn)物鑒定演講完畢，謝謝觀看！
教學(xué)課件相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號(hào)-1