dna重組及重組dna技術(shù)-資料下載頁(yè)
2025-01-08 01:52本頁(yè)面
【正文】 ransferase) 的作用下 ， 在 DNA片段末端加上同聚物序列 、 制造出粘性末端 ， 再進(jìn)行粘端連接 。 同聚物加尾連接 目錄 5180。 3180。 3180。 5180。 載體 DNA 5180。 3180。 3180。 5180。 目的基因 限制酶或機(jī)械剪切 限制酶 5180。 3180。 3180。 5180。 5180。 3180。 T(T)nT T(T)nT 3180。 5180。 5180。 3180。 3180。 5180。 3180。 A(A)nA A(A)nA 3180。 5180。 λ核酸外切酶 λ核酸外切酶 末端轉(zhuǎn)移酶 + dATP 末端轉(zhuǎn)移酶 + dTTP T4 DNA連接酶 15186。C 重組體 5180。 目錄 PCR法 ? 針對(duì)目的 DNA的 5?和 3?端 ， 設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物 ，在每條引物的 5?端分別加上不同的 RE位點(diǎn) ， 然后以目的 DNA為模板 ， 經(jīng) PCR 擴(kuò)增便可得到帶有引物序列的目的 DNA， 再用相應(yīng) RE切割 PCR產(chǎn)物 ， 產(chǎn)生黏端 ， 隨后便可與帶有相同黏端的線性化載體進(jìn)行有效連接 。 目錄 2. 平端連接 ?限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的平端 ?粘端補(bǔ)齊或切平形成的平端 適用于： 目的基因 載體 限制性內(nèi)切酶 限制性內(nèi)切酶 T4 DNA連接酶 15186。C 重組體 載體自連 目的基因 自連 目錄 3. 粘 平末端連接 ? 黏 平末端連接是指目的 DNA和載體之間通過(guò)一端為黏端、另一端為平端的方式進(jìn)行連接。 ? 屬于定向克隆 目錄 ?受體菌條件： 安全宿主菌 限制酶和重組酶缺陷 處于感受態(tài) (petent) ?導(dǎo)入方式： 轉(zhuǎn)化 (transformation) 轉(zhuǎn)染 (transfection) 感染 (infection) （四）重組 DNA轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞 —— 轉(zhuǎn) 目錄 1. 借助載體上的遺傳標(biāo)志進(jìn)行篩選 (1) 利用抗生素抗性標(biāo)志篩選 (2) 利用基因的插入失活 /插入表達(dá) 特性篩選 (3) 利用標(biāo)志補(bǔ)救篩選 (4)利用噬菌體的包裝特性進(jìn)行篩選 （五）重組體的篩選與鑒定 —— 篩 目錄 2. 序列特異性篩選 (1) RE酶切法 (2) PCR法 (3) 核酸雜交法 (4) DNA測(cè)序法 3. 親和篩選法 插入失活篩選帶有重組載體的克隆 α互補(bǔ)篩選（藍(lán) 白篩選） 菌落或噬斑原位雜交篩選重組體 目錄 重組 DNA技術(shù)操作過(guò)程可形象歸納為： 小結(jié) 分 分離獲取目的基因 選 載體的選擇與構(gòu)建 接 目的 DNA與載體連接 轉(zhuǎn) 重組 DNA轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞 篩 重組體的篩選與鑒定 目錄 重組 DNA技術(shù)操作的主要步驟 載體 質(zhì)粒 噬菌體 病毒 目的基因（外源基因） 基因組 DNA cDNA 人工合成 PCR產(chǎn)物 限制酶消化 開(kāi)環(huán)載體 DNA 目的基因 連接酶 重組體 轉(zhuǎn)化 體外包裝，轉(zhuǎn)染 帶重組體的宿主 篩選 表型篩選 酶切電泳鑒定 菌落原位雜交 目錄 表達(dá)體系的建立： ? 表達(dá)載體的構(gòu)建 ? 受體細(xì)胞的建立 ? 表達(dá)產(chǎn)物的分離純化 （六）克隆基因的表達(dá) 目錄 ? 標(biāo)準(zhǔn)： 選擇標(biāo)志 強(qiáng)啟動(dòng)子 翻譯調(diào)控序列 多接頭克隆位點(diǎn) ? ： 不宜表達(dá)真核基因組 DNA； 不能加工表達(dá)的真核蛋白質(zhì)； 表達(dá)的蛋白質(zhì)常形成不溶性包涵體 (inclusion body) ； 很難表達(dá)大量可溶性蛋白。 1. 原核表達(dá)體系 ( ) 目錄 ? 優(yōu)點(diǎn)： 可表達(dá)克隆的 cDNA及真核基因組 DNA 可適當(dāng)修飾表達(dá)的蛋白質(zhì) 表達(dá)產(chǎn)物分區(qū)域積累 ? 缺點(diǎn)： 操作技術(shù)難、費(fèi)時(shí)、經(jīng)濟(jì) ? 轉(zhuǎn)染 —— 將表達(dá)載體導(dǎo)入真核細(xì)胞的過(guò)程 方法： 磷酸鈣轉(zhuǎn)染 DEAE葡聚糖介導(dǎo)轉(zhuǎn)染 電穿孔 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染 顯微注射 （酵母、昆蟲、乳類動(dòng)物細(xì)胞） 目錄 第三節(jié) 重組 DNA技術(shù)在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用 Application of Rebinant DNA Technology in Medicine 目錄 一、重組 DNA技術(shù)廣泛應(yīng)用于生物制藥 ?利用基因工程生產(chǎn)有藥用價(jià)值的蛋白質(zhì)、多肽產(chǎn)品已成為當(dāng)今世界一項(xiàng)重大產(chǎn)業(yè)，并將有望成為 21世紀(jì)的支柱產(chǎn)業(yè)。 ?美國(guó) Eli Lilly公司于 1982年首先利用重組DNA技術(shù)合成人胰島素并投放市場(chǎng) ， 標(biāo)志著生物工程藥物時(shí)代的開(kāi)始 。 迄今為止 ， 已有50多種基因工程藥物上市 ， 近千種處于研發(fā)狀態(tài) ， 形成一個(gè)巨大的高新技術(shù)產(chǎn)業(yè) ， 產(chǎn)生了不可估量的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益 。 重組 DNA醫(yī)藥產(chǎn)品 產(chǎn) 品 功 能 組織胞漿素原激活劑 抗凝 血液因子 VIII 促進(jìn)凝血 顆粒細(xì)胞 巨噬細(xì)胞集落剌激因子 剌激白細(xì)胞生成 促紅細(xì)胞生成素 剌激白細(xì)胞生成 生長(zhǎng)因子 (bFGF, EGF) 刺激細(xì)胞生長(zhǎng)與分化 生長(zhǎng)素 治療侏儒癥 胰島素 治療糖尿病 干擾素 (? 1b, ?2a, ? 2b, ?) 抗病毒感染及某些腫瘤 白細(xì)胞介素 激活、剌激各類白細(xì)胞 超氧化物歧化酶 抗組織損傷 單克隆抗體 利用其結(jié)合特異性進(jìn)行診斷試驗(yàn)、腫瘤導(dǎo)向治療 乙肝疫苗 (CHO, 酵母 ) 預(yù)防乙肝 口服重組 B亞單位菌體霍亂菌苗 預(yù)防霍亂 目錄 二、重組 DNA技術(shù)還應(yīng)用于醫(yī)學(xué)的其他諸多方面 ? 疾病相關(guān)基因的發(fā)現(xiàn)與鑒定 ? 轉(zhuǎn)基因和基因打靶 ? 加速了人類基因組計(jì)劃的完成 ? 疾病的基因診斷和基因治療 目錄 演講完畢，謝謝觀看！
教學(xué)課件相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號(hào)-1