【正文】 R. Hamilton et al. Science 313. 1441. 2021 YSH577 rEPO JC308 WT YSH597 b1,NGlcNAc b1,4GlcNAc b1,2GlcNAc b1,4Man a1,6Man a1,3Man a1,2Man b1,4Gal a2,6Sia RDP750 重組巴斯德畢赤酵母分泌的 rEPO的鑒定 JC308 WT RDP750 YSH557 YSH597 Y11430 WT YSH551 YSH577 rEPO 重組 rEPO的 HPLC圖譜分析： 重組巴斯德畢赤酵母分泌的 rEPO的鑒定 JC308 WT RDP750 YSH557 YSH597 Y11430 WT YSH551 YSH577 rEPO 重組 rEPO的血細胞比容分析 ： YSH551株 YSH597株 注射第 8 天 注射第 15天 H 酵母轉錄機器的基因工程綜合改造 6 外源基因在酵母中的表達 化石能源的日益消耗大大促進了可再生型生物燃料 （ 如乙醇等 ） 的開發(fā)與生產 。 然而 ， 大規(guī)模發(fā)酵生產燃料乙醇的關鍵是酵母對高濃度乙醇和葡萄糖的耐受性 。 長期以來 ， 人們普遍關注的是對乙醇生物合成基因和耐受基因的遺傳操作 ， 這些努力雖然取得了顯著的進步 ， 但似乎觸及了極限 。 基因工程改良能否突破這一極限呢 ？ Hal Alper等人提出的所謂 轉錄機器綜合基因操作戰(zhàn)略 （ Global transcription machinery engineering， gTME）讓我們看到了新的希望。 釀酒酵母轉錄機器的定向改造 在釀酒酵母中 ， 乙醇生物合成基因與其他看家基因一樣 ， 由 RNA聚合酶 II 負責轉錄 。 RNA聚合酶 II 系統(tǒng)包含 75 種一般轉錄因子或共激活因子 ， 其中最關鍵的是TFIID復合物 ， 包含 TATABOX結合蛋白 （ TBP， 由基因 SPT15 編碼 ） 及其及 14 種激活因子 （ TAFs） 。 有證據(jù)顯示 ， TATABOX結合蛋白的突變會改變 RNA聚合酶對啟動子的特異性識別性質 ， 進而影響眾多不同基因的表達譜 。 這便是 轉錄機器綜合基因操作戰(zhàn)略 的 Hal Alper et al. Science 314. 1565. 2021 理論基礎。 TATABOX TBP TAFs TFIID plex 釀酒酵母轉錄機器的定向改造 Hal Alper et al. Science 314. 1565. 2021 利用易錯 P C R技術 構建SPT15的突變文庫 ， 轉入釀酒酵母標準單倍體 BY4741株 ， 該單倍體含有內源性野生型的 SPT15染色體拷貝 。然后在逐次提高的高濃度乙醇和葡萄糖存在下篩選耐受 突變株。 當篩選壓力增加到 6%的乙 醇和 120g/L的葡萄糖時 ， 獲得 spt15300突變株 ， 它相對野生株的耐受倍數(shù)達 13倍 。 釀酒酵母轉錄機器的定向改造 Hal Alper et al. Science 314. 1565. 2021 利用易錯 P C R技術 構建SPT15的突變文庫 ， 轉入釀酒酵母標準單倍體 BY4741株 ， 該單倍體含有內源性野生型的 SPT15染色體拷貝 。然后在逐次提高的高濃度乙醇和葡萄糖存在下篩選耐受 突變株。 spt 15 300突變株即使在 15%的乙醇存在下，也顯示出比對照野生株高出近 1倍的耐受性。 spt15300突變株的鑒定 Hal Alper et al. Science 314. 1565. 2021 具有優(yōu)良特性的 spt15300突變株包含三個突變位點 ， 它們均集中在TBP的重復序列 2結構域中 。 實驗結果顯示 ， 任何單一或兩兩組合位點的突變 ， 都不能產生顯著的功效 ， 巴斯德畢赤酵母 TATABOX結合蛋白變體 Spt15300 Repeat Element 1 Repeat Element 2 Helix 2 Helix 2’ F177S Y195H K218R 突變的相對累積效應 這充分表明三聯(lián)突變的重要性。 spt15300突變株的鑒定 Hal Alper et al. Science 314. 1565. 2021 轉錄譜分析結果表明 ， 在無壓力的條件下 ， spt15300突變株相對于野生株 ，展示出數(shù)百個基因不同程度的表達 ，但大多集中在氧化還原酶 、 胞質蛋白質 、 氨基酸代謝 、電子傳遞鏈等功能范圍內 。 突變 株中表達最高的 12個基因，如果被單獨敲除，則由 spt15300突變造成的優(yōu)勢全部喪失 spt15300突變株的鑒定 Hal Alper et al. Science 314. 1565. 2021 spt15300突變株乙醇發(fā)酵的性能參數(shù) 性能參數(shù) 突變株 野生株 改善效果 起始干細胞重量（ DCW， g / L） 最終干細胞重量（ DCW， g / L） 體積生產率（ g / L h1） 比生產率（ g / DCW h1） 轉化率（ 6 12 h） 乙醇與生物量比值 理論值為 （ g / g） + 20 % + 69 % + 41 % + 14 % + 15 % 98% 86% E 酵母的表達系統(tǒng) 6 外源基因在酵母中的表達 C 酵母的載體系統(tǒng) B 酵母的宿主系統(tǒng) A 酵母作為表達外源基因受體的特征 F 利用重組 酵母生產乙肝疫苗 D 酵母的轉化系統(tǒng) G 酵母糖蛋白生產的人源化改造 H 酵母轉錄機器的基因工程綜合改造 64252515（ O） 1390187451