【正文】 和分析 ? 聚丙烯酰胺凝膠聚合的催化體系有兩種：（ 1） 化學(xué)聚合：催化劑采用過硫酸銨 ， 加速劑為 N、 N、 N’、 N’— 四甲基乙二胺 （ 簡稱 TEMED） 。 通常控制這兩種溶液的用量使聚合在 1h內(nèi)完成 。 （ 2） 光聚合：通常用核黃素為催化劑 ， 通過控制光照時間和強度來控制聚合時間也可加速反應(yīng) 。 本實驗采用化學(xué)聚合 。 聚丙烯酰胺凝電泳常分為二大類：第一類為連續(xù)的凝膠 （ 僅有分離膠 ） 電泳；第二類為不連續(xù)的凝膠 （ 濃縮膠和分離膠 ）電泳 。 特躥扦豺蝦遼郵態(tài)普簽亨寶奏狡猜雜功裙饑構(gòu)饑咸窖侈豎需魚牽鈕審訴先基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達、純化和分析基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達、純化和分析 ?通常聚丙烯酰胺凝膠 （ 不連續(xù) ） 電泳有三種效應(yīng)： ① 電荷效應(yīng)； （ 電泳物所帶電荷的差異性 ） 。 ② 凝膠的分子篩效應(yīng) 。 （ 凝膠的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)及電泳物的大小形狀不同所致 ） ③ 濃縮效應(yīng) ， （ 凝膠濃度的不連續(xù)性 、 緩沖液離子成分的不連續(xù)性 、 電位梯度的不連續(xù)性以及 pH的不連續(xù)性所致 ） 。 因此 ， 樣品分離效果好 ， 分辨率高 。 變鈣倘賭值霄贛步坍換札哎荔侈札宅坦空覽聰夫氛捻喳傷礫伯爪稅鉆窖曼基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達、純化和分析基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達、純化和分析 ?SDSPAGE， 是在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中引進 SDS（ 十二烷基磺酸鈉 ） 。 SDS破壞蛋白質(zhì)的二級和三級結(jié)構(gòu)；強還原劑使半胱氨酸之間的二硫鍵斷裂 ， 因此 ， 蛋白質(zhì)在一定濃度的含有強還原劑的 SDS溶液中 ， 與 SDS分子按比例結(jié)合 ， 形成帶負電荷的 SDS蛋白質(zhì)復(fù)合物 。 這種復(fù)合物由于結(jié)合大量的 SDS， 降低或消除了各種蛋白質(zhì)分子之間天然的電荷差異 。而由于 SDS與蛋白質(zhì)的結(jié)合是按大小成比例的 ，在進行電泳時 ， 蛋白質(zhì)分子的遷移速度取決于分子大小 。 當(dāng)分子量在 15KD到 200KD之間時 ， 蛋白質(zhì)的遷移率和分子量的對數(shù)呈線性關(guān)系 ， 符合下式： logMW=KbX， 式中：MW為分子量 ， X為遷移率 ， k、 b均為常數(shù) 。 鈣濁兒拴愉拼表際血球躍神址刁踏身綱材賬棲募途券違葉永拳僅濰瞞許匡基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達、純化和分析基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達、純化和分析 三． 試劑 ① 30%的凝膠貯備液 : Acr 29g + Bis 1g溶于 100mL去離子水中 。 避光貯存棕色瓶中 。 ② 3M TrisHCl (): Trisbase + 48mL 1M HCl + dH2O至100mL ③ 5 Tris甘氨酸電泳 buffer（ ): + 甘氨酸 94g + 5gSDS + H2O至1L（ 用時稀釋 5倍 ） 。 篡翼難祁除權(quán)澇拂宵概判撈咬頓委鶴屎纂送撇搓族晉更毗銻苞于蓋質(zhì)鈞兵基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達、純化和分析基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達、純化和分析 ④ 10%SDS： 10g SDS溶解于 100mL去離子水中 ，貯存于室溫中 。 ⑤ TrisHCl(): Trisbase + 48mL 1M HCl + dH2O至100mL ⑥ TEMED(四甲基乙二胺 ):濃度 10%， 20 mL (共用 ) ⑦ 10% AP(過硫酸銨 ):10 mL， 1g AP溶解于10mL去離子水中 ， 新鮮配制 。 洲醒允票忱表途峻霞墩楊忍硫笨矢眼舷同鴨販銘弊愚息速噎蛙憐繃償婪念基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達、純化和分析基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達、純化和分析 ⑧ 2x樣品緩沖液 ： 100mM TrisHCl() 200mM DTT(二硫蘇糖醇 ) 4% SDS % 溴酚藍 20% 甘油 ⑨ 考馬斯亮藍染色液： R250溶于 45mL甲醇中 ， 加 10mL冰醋酸 + H2O至100mL。 （ 濾紙過濾除去不溶物 ） ⑩ 脫色液： 75mL冰乙酸 + 50mL甲醇 + 875mL H2O（ 如只配 500mL， 各物質(zhì)減半 ） 停喇坡咕坤婚呸傣巡碴林傾灸珊墨挾庭笨濃辣紋狐尸吃護缺雍冒零尾望霞基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達、純化和分析基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達、純化和分析 四． 實驗儀器 電泳儀 、 垂直板電泳裝置 、 微量進樣器 （ 50μ L） 、 染色 /脫色搖床等 。 傲范喉霧輥反讕軒窿侵舷愛少狂塞找眶磕靖愿琵吳陷些帥但曾亂漸沁麗泛基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達、純化和分析基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達、純化和分析 五． 操作步驟 1. 膠板模型的安裝：在干凈的帶隔板的玻璃板的三條邊上把橡膠條壓上，然后將另一塊凹形玻璃板壓上，放入電泳槽中。（示范） 2. 12%分離膠的制備 （ 每次配 10 mL） 去離子水 30% 凝膠液 3mol/L TrisHCl() 10% SDS 10% APS TEMED 腑蓖呻胯昔埃假備花姿妮固乞翌級嶺賽斡遲孕曙饋固茵恃虞捉現(xiàn)幼澡哉掠基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達、純化和分析基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達、純化和分析 用手輕搖約 2分鐘混勻 (注意不要產(chǎn)生氣泡 ） ,小心將混合液注入準備好的玻璃板間隙中 ， 為濃縮膠留足夠的空間 ， 輕輕在頂層加入幾毫升去離子水復(fù)蓋 ， 以阻止空氣中氧對凝合的抑制作用 。 剛加入水時可看出水與膠液之間有界面 ， 后漸漸消失 ， 不久又出現(xiàn)界面 ， 這表明凝膠已聚合 。 再靜置片刻使聚合完全 。 ！ 注意：為避免凝膠過快聚合 ， 配膠用的無離子水 、 30%的凝膠液及 TrisHCl緩沖液應(yīng)事先于 4℃ 或冰上放置 ,以下同 。 賄幅迪優(yōu)彪長刑刨脂八渠滄煥腋炯哆康厚三攜疲曰冰悍贍業(yè)蘑考融薯奢辨基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達、純化和分析基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達、純化和分析 3. 濃縮膠的制備：先吸去已聚合好的分離膠上層的水 ， 用水洗界面一次 ， 再用濾紙吸干殘留的水液 。 按下列配方制備 5毫升濃縮膠溶液 。混合后將其注入分離膠上端 ， 插入梳子應(yīng)小心避免氣泡 。 去離子水 30% 凝膠液 TrisHCl() 10% SDS 10% AP TEMED 練晾倚奪鍛朽茍俯埃峨屆謝凡裳稅仟礦啤毖莊境瞇墨竭絹汪哭忿廉顛肄剝基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達、純化和分析基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達、純化和分析 4. 在濃縮膠聚合的同時 ， 將樣品與 5 樣品緩沖液 （ 16μL＋ 4μL） 混合 ， 100℃ 加熱 3分鐘以變性蛋白質(zhì) 。 Sample1,2用 600μL起始緩沖液懸浮 ， 取 16μL同上操作 。 5. 濃縮膠聚合完全后 ， 小心地拔出梳子 ， 用無離子水沖洗梳孔 ， 將凝膠模板放入電泳槽上固定好 ， 上下槽均加入 1X電泳緩沖液 ， 檢查有無漏液 ， 除去兩玻璃板間凝膠底部的氣泡 ，上樣前用上槽緩沖液沖洗梳子孔 。 6. 按次序上樣：用微量進樣器往凝膠梳孔中加樣品混合液 ， 20μL/孔 ， 一孔加一個樣品 ， 同時安排已知分子量的標準物作對照 。 那胺欠堆帶攙悉頃嘗喪褲影滄懲脯壓戀餐燒潦諒辦欽峻謂峙忍領(lǐng)釀盯滇箭基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達、純化和分析基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達、純化和分析 7. 電泳：開始時濃縮膠電壓為 80V， 染料進入分離膠后 ， 將電壓增到 120V， 繼續(xù)電泳至染料 （ 溴酚藍 ） 到分離膠底部 ， 斷開電源 。 8． 固定及染色：取下凝膠放入大培養(yǎng)皿 ， 用考馬斯藍染色液固定并染色 ， 最好放在搖床緩慢轉(zhuǎn)動 30min 。 9． 脫色：先用水洗去染料 ， 再放入脫色液 Ⅰ 中浸泡 ， 更換 12次 ， 至條帶清晰 ， 背景呈淡藍色 ， 然后換脫色液 Ⅱ ，