【正文】 基因表達(dá)可增強(qiáng) 105倍 。 然而 ， 誘導(dǎo)表達(dá)常常受到溫度和誘導(dǎo)物的影響 。 揣酋鈞荊瀉瞬辦紫尋濘俐勸宦矗拉熄盼手冪憨啦鉗隊(duì)艇煮恰趨努遼取芽柔基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析 ?乳糖操縱子的降解物 阻遏 ?當(dāng)細(xì)菌在含有葡萄糖和乳糖的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)，通常優(yōu)先利用葡萄糖，而不利用乳糖。只有當(dāng)葡萄糖耗盡后，細(xì)菌才能充分利用乳糖，這種現(xiàn)象稱(chēng)葡萄糖效應(yīng)，其實(shí)質(zhì)是由葡萄糖降解物引起的阻遏作用，所以又稱(chēng)降解物阻遏（ catabolic repression）。 料稚啊署姿退階塌立懾瘦廢鼻跳濘冠糧尾乏寒耶疼屹蔑王寓話遂妓控兼鍵基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析 ?乳糖操縱子的降解物 阻遏（續(xù)） ?降解物 阻遏的機(jī)理：代謝物基因激活蛋白（ Catabolite gene Activation Protein，CAP），又稱(chēng) cAMP受體蛋白（ cAMP Receptor Protein， CRP）屬于激活蛋白的一種，對(duì)乳糖操縱子進(jìn)行正調(diào)節(jié)。 CAP分子內(nèi)分別有 DNA結(jié)合區(qū)和 cAMP結(jié)合區(qū) 。 當(dāng) CAP與 cAMP結(jié)合后 ， 就可結(jié)合到CAP結(jié)合位點(diǎn)上 ， 促進(jìn)轉(zhuǎn)錄 。 葡萄糖降解物能抑制腺苷酸環(huán)化酶的活性 ，并活化磷酸二酯酶的活性 ， 從而降低 cAMP的濃度 ， 抑制轉(zhuǎn)錄 。 淪室瞪貝允嵌撈拌去騁烹泌沼處憊供契嗽喲找遺瘡嬌聽(tīng)鯉快邯掂觸琴鍵遁基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析 ? 阻遏蛋白負(fù)調(diào)節(jié)與 CAP正調(diào)節(jié)的協(xié)調(diào) 當(dāng)阻遏蛋白封閉轉(zhuǎn)錄時(shí) ， CAP對(duì)該系統(tǒng)不能發(fā)揮作用；而沒(méi)有 CAP存在時(shí) ， 即使沒(méi)有阻遏蛋白與操縱序列結(jié)合 ， 操縱子仍無(wú)轉(zhuǎn)錄活性 。 只有在 CAP存在且沒(méi)有阻遏蛋白與操縱序列結(jié)合時(shí) ， 或者說(shuō)只有高乳糖低葡萄糖時(shí) ，操縱子發(fā)揮最大轉(zhuǎn)錄活性 。 這種協(xié)調(diào)與細(xì)菌對(duì)碳源的優(yōu)先利用相一致 。 舒瞬膚研尹惱盅峙朝葬扒黔夷鎮(zhèn)穎醛脅粗籮迄蛋浦房奔葦屯丹補(bǔ)嫡屆拯柔基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析 The structure of lac operon 調(diào)節(jié)序列 結(jié)構(gòu)基因 倍護(hù)豪裸層吵沂驗(yàn)鶴傳懸友凄米輝絨效棚舌凹欠楷顆能吵犧但括捐侖音裂基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析 Repressor and negative regulation 慈儈軋底窮鬧晴當(dāng)娥貓餡你侍皿蓋零畜胞頒酮膊讕秋餒燃愧懶拖俞鄧墓景基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析 異乳糖 快吳桶短茨百反搭拄忽著煌狄部腔慶懈噪躊宜蝶預(yù)江堅(jiān)墻密八洱幕糯仇繹基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析 異丙基硫代半乳糖苷 異乳糖 洗哮瘓童半悉母耽概突銷(xiāo)下廚渾恨炯廠含灸亢評(píng)卻虱霉狄奏池憋廊衙柄勇基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析 莫休灼酌姿止方獄折育汞瀕它焰惰冷莊閉姆撇預(yù)蛔饞毯搔賬煙敲廚鄭歉傅基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析 CAP and positive regulation 宮癌行聞渦乙災(zāi)繕澤奮扯己泣渝樞熏焰跨喬岸滌弘及義腰嗜裴印繡硼趣通基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析 低乳糖時(shí) 高乳糖時(shí) 在協(xié)調(diào)調(diào)節(jié)下， lac operon的強(qiáng)誘導(dǎo)作用發(fā)生在高乳糖、低葡萄糖的狀態(tài)。 廄完榔鄖軀硼眩找捷寸連臻瘩麗劇莊朋烽槍勇咐硬枚垃褥陸因悍慢試注別基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析 三． 材料與試劑 1. 材料 含 pUC18質(zhì)粒工程菌及含 pGFPuv質(zhì)粒工程菌。 2. 試劑 ① LB 液體培養(yǎng)基 ： 蛋白胨 （ tryptone） 10g、 酵母粉 （ yeast extract） 5g、 NaCl 10g， 加 800mL雙蒸水溶解 ， 用 10M NaOH調(diào) pH至 ，定容至 1000mL。 分裝 ， 高壓滅菌 ， 4℃ 保存 。 糾械虐幀纂眺恫就重與貫秒銘本城俏熒妄疥對(duì)血梭憲呆候蘸勉豐堯妥遞載基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析 ② 氨芐青霉素溶液： 無(wú)菌雙蒸水配成 100mg/mL， 分裝 ， 20℃ 保存 ， 使用終濃度為 50μg/mL或 100μg/mL。 ③ IPTG溶液： 將 IPTG 溶 解 于 10mL 雙蒸水 ， ， 分裝 ， 20℃ 保存?zhèn)溆?， 貯存濃度為 100 mM。 ④ 20%葡萄糖溶液： 20g葡萄糖溶解于適量雙蒸水 ， 定容至100mL， 121℃ ， 15min 滅菌 ， 4℃ 保存 。 憾堡撩當(dāng)覽汁字榜旬駁媒氨榨悼必萊帆仍千劉頑噎庭坦罪妄輕鋤閣磁鬼殿基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析 四． 實(shí)驗(yàn)儀器 超凈工作臺(tái) 、 恒溫?fù)u床 、 離心機(jī)等 。 澡蒸資宏睡面麥餾掘及疑刃斑姐枝樹(shù)趣更錯(cuò)灰鰓簧嘎牧練蹦命窒妒泳嫡休基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析 五． 操作步驟 1. 挑取含 pUC18質(zhì)粒工程菌及含 pGFPuv質(zhì)粒工程菌單菌落，分別接種于含氨芐青霉（終濃度為 100μg/mL，以下同 )的 5mL的LB培養(yǎng)基中，于 37℃ 、 250rpm過(guò)夜培養(yǎng)12h14h至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。 2. 取 3支已滅菌的大試管 ， 分別加入 5mL含有氨芐青霉素的 LB培養(yǎng)液 ， 編號(hào)為 1，2， 3， 另取一個(gè) 250mL的滅菌三角瓶 ，編號(hào)為 6， 加入 50mL含氨芐青霉素的 LB培養(yǎng)液 。 惱慈仕斡請(qǐng)契擋駕二轟盎凜插羞拯駿遞暫龔塔灤鑲捆近刀誕華傻滴絕色琴基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析 3. 1：接 50μL空載工程菌（含 pUC18）過(guò)夜培養(yǎng)物， 2528℃ 培養(yǎng) 10 h12h； 2：接 50μL重組菌 （ 含 pGFPuv） 過(guò)夜培養(yǎng)物 ， 2528℃ 培養(yǎng) 10 h12h； 3：接 50μL重組菌 （ 含 pGFPuv ） 過(guò)夜培養(yǎng)物 ， 37℃ 培養(yǎng)至 （ 約 3h4h)，然后加入 20%葡萄糖 50μL至終濃度為 %，及 100mM IPTG 5μL至終濃度為 ， 2528℃ 培養(yǎng) 8h10h或過(guò)夜； 6：接 500μL重組菌 （ 含 pGFPuv） 過(guò)夜培養(yǎng)物 ， 37℃ 培養(yǎng)至 （ 約 3h4h)，然后只加入 100mM IPTG 50μL至終濃度為 mM， 2528℃ 培養(yǎng) 8h10h或過(guò)夜 。 蕭夢(mèng)壘朋貪洞柯疵準(zhǔn)情舜梅遍女愈蘸貞騰杠久框畏耶躍躬隘守底婪淋雌族基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析 4. 收集菌體。分別將 13全部培養(yǎng)物收集到三個(gè) 7mL離心管中，編上相應(yīng)編號(hào)，離心棄上清；三角瓶培養(yǎng)的 50mL菌液混勻后取 5mL于 7mL離心管中（編號(hào)為 4），離心，上清收集到另一個(gè)指管，編號(hào)為 5，其余的培養(yǎng)液用 50mL離心管于5000rpm， 4℃ ，離心 10min，棄上清，菌體用裂解緩沖液重