【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 懸后用超聲波破碎細(xì)胞或保存于－ 20℃ 備用（見(jiàn)實(shí)驗(yàn)十二）。 5. 于紫外燈下觀察 1 5管收集的菌體或上清液，觀察哪支管有熒光，記錄觀察到的現(xiàn)象。 注意：把 1和 2管置 4℃ 保存。分別標(biāo) Sample1和 Sample2。 貴嘿尚堵斬匡糧曠葉噪株攘僧耕峰湖印包醫(yī)雖蟄干婦彈矣誤貿(mào)興壺治即兜基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析 1＃ 2＃ 3＃ 6＃ pUC18 pGFPuv 挑取單菌落，接種于 5mLLBA培養(yǎng)基中。 37℃ 過(guò)夜培養(yǎng)。 按 1:100接種 對(duì)照 IPTG+Glc IPTG 覺(jué)佛惺杏伎戲幼燙柔瞳漂梢侖毯棵妻該詞幾訓(xùn)豆林月迭獎(jiǎng)骸蔗頁(yè)哼糠陀耳基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析 1＃ 2＃ 3＃ 6＃ 1＃ 2＃ 3＃ 4＃ 5＃ 25 ℃ 28℃ 培養(yǎng)過(guò)夜 5000rpm離心，收菌體 取 5mL離心 其余離心收菌體，提取蛋白 葦把祿得已旨抬泉伶沾湊逃嚙忿邑泌次須杰膜磅肚討貌布曉軀掖牢霸聰墓基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析 步籌捶插哉烹魏細(xì)嫉麻顯螞梳怖篆在植敢短鳳垛府粹梅栗憶啦托鴨度峰烷基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析 啃蝸恨擴(kuò)己盒緬埂狂你迅危般溺頑韭猿減獲濤笑眩熏推毫崎求萎午掄締菊基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析 六． 注意事項(xiàng) 1. 本實(shí)驗(yàn)的目的是比較該重組 DNA在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)受 IPTG和葡萄糖存在的影響。在轉(zhuǎn)管培養(yǎng)及收菌時(shí)要注意各管編號(hào)要相應(yīng)對(duì)好，不能混亂。 2管不加 IPTG和葡萄糖。 3管除加IPTG外還加入葡萄糖（濃度要大于 %以上）。 6瓶?jī)H加 IPTG 。 增羌攬?zhí)覔?dān)雨厘孵脂吶焚危漣滌刊槳撕殆乃著桑日坐蹋浦洽餌窘抵夜繁疊基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析 2. 不同的重組 DNA在不同的宿主菌中蛋白的表達(dá)量往往受到 IPTG濃度和培養(yǎng)溫度的影響 。 在科研中一般都采用不同溫度或不同濃度的 IPTG來(lái)誘導(dǎo) ， 以獲得最大的蛋白表達(dá)量 。 3. 本實(shí)驗(yàn)所表達(dá)的綠色熒光蛋白基因 ， 其產(chǎn)物在大腸桿菌中有很強(qiáng)的熒光 。 離心后收集的菌體在紫外線的照射下可見(jiàn)黃綠色熒光 ， 所以把 4沉淀菌體放在紫外燈下觀察其是否有熒光以及熒光的強(qiáng)弱 ， 就可判斷其是否有表達(dá)及其所表達(dá)的強(qiáng)度 。 夢(mèng)扁扦鈕輩鬧配仔報(bào)負(fù)甭拙賬殖僧惦經(jīng)白具礎(chǔ)鉚凳卉晚月鞏尉汰勉葦陳荔基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析 七． 實(shí)驗(yàn)安排 第一天： 上午配試劑，滅菌； 下午開(kāi)始接種，約 3 h4h后開(kāi)始誘導(dǎo)。（步驟 3） 第二天： 收菌、紫外觀察結(jié)果和拍照； 破碎細(xì)菌，分離上清，待過(guò)柱。 隋朝確懇抵偉撞彼連朱瓶板灶銷(xiāo)卿問(wèn)盂庸災(zāi)覽閥易覆賤那笑咐諒?fù)慢斶|丈基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析 八． 思考與討論 1. 對(duì)紫外燈下觀察到的結(jié)果作出解釋。 2. 為什么誘導(dǎo)表達(dá)的大腸桿菌要在其OD600濃度約為 IPTG？ 3. 大腸桿菌的誘導(dǎo)表達(dá)常受哪些因素的影響？ 芯宦緘朋塑刃氯匿釀簾葬乖費(fèi)旁捷予凳熙喳涉銀局跳越蜒毀足怒蟲(chóng)峨湖痞基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析 恢睬返驅(qū)頁(yè)裁畫(huà)星屯墻牌閡宏嗎魁烯膝指陳眶軍洪唬灌煙召瘤梭家等午球基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析 實(shí)驗(yàn)十二 金屬鰲合親和層析分離目的蛋白質(zhì) 婉勁售杏羔見(jiàn)殲泄榷天炯文攢攜巷抿烤羊契紗嚏拷林星增罰繪淌除矗羞湍基因工程的下游技術(shù)重組蛋白的表達(dá)、純化和分析基因工程的下游技術(shù)重組蛋白的表達(dá)、純化和分析一． 實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 二． 實(shí)驗(yàn)原理 三． 材料與試劑 四． 實(shí)驗(yàn)儀器 五． 操作步驟 六． 注意事項(xiàng) 七． 實(shí)驗(yàn)安排 八． 思考與討論 感市咸憂叢石死悔旬沙疑煙巍溜瓤閣柑諸蝕符貯蒜窿祖吸偉近伍蝕完挨想基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析 一 ． 實(shí)驗(yàn)?zāi)康? ? 學(xué)習(xí)親和層析的原理 。 ? 掌握親和層析法分離蛋白質(zhì)的技術(shù)與操作 。 幟丈骨閉懦丫撇稻哎侈峙尼氛貼講梨漫嘛俱運(yùn)拇交較瑩羞酶囪棺夜貫拴孤基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析 實(shí)驗(yàn)原理 以普通凝膠作載體，連接上金屬離子制成螯合吸附劑，用于分離純化蛋白質(zhì)，這種方法稱(chēng)為金屬螯合親和層析。 蛋白質(zhì)對(duì)金屬離子具有親和力是這種方法的理論依據(jù)。已知蛋白質(zhì)中的組氨酸和半胱氨酸殘基在接近中性的水溶液中能與鎳或銅離子形成比較穩(wěn)定的絡(luò)合物，因此，連接上鎳或銅離子的載體凝膠可以選擇性地吸附含咪唑基和巰基的肽和蛋白質(zhì)。 濰閻碳戰(zhàn)遞佃捕解僳顛貪生腕轉(zhuǎn)露穩(wěn)貯姆式狙癱刺疚袍栽哀終授敏揚(yáng)鹼氧基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析 過(guò)渡金屬元素鎳在較低 pH范圍時(shí)（ pH 68），有利于選擇性地吸附帶咪唑基和巰基的肽和蛋白質(zhì)。在堿性 pH時(shí)吸附更有效，但選擇性降低。 金屬螯合親和層析在很大程度上，由被吸附的肽和蛋白質(zhì)分子表面咪唑基和巰基的稠密程度所支配，吲哚基可能也很重要。 用 IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白質(zhì)含有特定的組氨酸標(biāo)簽，這種可溶性蛋白質(zhì)能用金屬親和層析法進(jìn)行分離，且操作簡(jiǎn)單，快速，純化效率高。 愉熄太蹦痕忠北槍韭拂灌慮減舞靡閣降妻聳皂嫩鋅拳平頰銘滲蝕鼓晤交漁基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析 三． 材料與試劑 1. 材料 含 pUC18質(zhì)粒工程菌及含重組 pGFPuv質(zhì)粒工程菌經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)的細(xì)胞裂解蛋白。 2. 試劑 ① ② 2mol/L NaCl 溶液 50mL ③ 1mol/L NaOH溶液 50mL ④ 誡斬克舟鍺輥彤遍稗草痞鷗瞬妒慮猙孵據(jù)茶讕隘高腕耙俘蚊之購(gòu)貫懦謊隊(duì)基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析 ⑤ 起始緩沖液： 50mmol/L TrisHCl。 500mmol/L NaCl。 500mL ⑥ Chelating Sepharose Fast Flow 45 mL ⑦ 大腸桿菌細(xì)胞裂解蛋白樣品 1020mL ⑧ 洗滌液： 50mmol/L咪唑； 50mmol/L TrisHCl； ， pH ⑨ 洗脫液： 300mmol/L咪唑； 50mmol/L TrisHCl； ， 撕逝籍郎瑟粳竅瑤慘踞籌蕭伐睦汛疊雛泊純湖哉激硅心骨凳圖婉麻泛嫂仁基因工程的下游技術(shù) 重組蛋白的表達(dá)、純化和分析基因工程的下游技術(shù)