基因工程7克隆基因的表達概述(編輯修改稿)
2025-04-02 18:56 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 一種需要 ?終止蛋白質(zhì)的參與 。 依賴于 ?蛋白質(zhì)的終止反應(yīng) ， 對一些調(diào)節(jié)機理而言是十分重要的 。 協(xié)助 RNA聚合酶識別終止信號的輔助因子(蛋白質(zhì) )稱為 終止因子 (termination factors)。 有些終止子的作用可被特異的因子所阻止 ， 使RNA聚合酶得以越過終止子繼續(xù)轉(zhuǎn)錄 ， 這稱為通讀 (readthrough)， 這類引起抗終止作用的蛋白質(zhì)叫 抗終止子因子 (antitermination factors)。 在克隆基因的末端 ， 存在一個轉(zhuǎn)錄終止區(qū)是十分重要的 ， 這是因為： (1) 若干非必需的轉(zhuǎn)錄本的合成 ， 會使細胞消耗巨大的能量 ， 用于制造大批不必要的蛋白質(zhì)； (2) 在轉(zhuǎn)錄本上有可能形成一些不希望其出現(xiàn)的二級結(jié)構(gòu) ， 從而降低轉(zhuǎn)譯效率； (3) 有時會出現(xiàn)啟動子阻塞現(xiàn)象 ， 克隆基因啟動子所開始的轉(zhuǎn)錄 ， 有時會干擾另一個必要的基因或調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄 。 轉(zhuǎn)錄終止區(qū)的存在 ， 可使上述這幾種不利的現(xiàn)象得以避免 。 轉(zhuǎn)譯 （ 翻譯 ） mRNA ? 蛋白的過程 。 原核生物的轉(zhuǎn)譯過程包括多肽鏈合成的起 始 、 延長和終止三個步驟 。 1. 轉(zhuǎn)譯起始序列 mRNA有效地轉(zhuǎn)譯依賴于 mRNA的穩(wěn)定性及結(jié)合到核糖體上的能力 。 大腸桿菌 mRNA的核糖體結(jié)合位點是轉(zhuǎn)譯的起始密碼子及 SD序列 ， 要獲得良好的表達 ， 關(guān)鍵是起始密碼子以及 SD序列必須處在易接觸的部位 。 細菌的起始密碼子 （ initiation codon, initiator） 通常是 AUG， 它轉(zhuǎn)譯為 n甲酰基甲硫氨酸；少數(shù)情況下是 GUG， 轉(zhuǎn)譯為纈氨酸 。 真核生物的起始密碼子總是 AUG， 并轉(zhuǎn)譯為甲硫氨酸 （ 其在 DNA中的相應(yīng)順序為ATG） 。 所謂 SD序列是由 ShineDalgarno首先提出 ，為細菌核糖體有效結(jié)合和轉(zhuǎn)譯起始所需要的序列 。 它以不同長度 （ 3~9個 bp） 組成 ， 包含5’UAAGGAGGU3’的全部或其中的一部分 ，位于 mRNA 5’末端不轉(zhuǎn)譯的前導區(qū)段內(nèi) ， 其起點距轉(zhuǎn)譯起始密碼子 AUG約 3~11個堿基 。這個 SD序列與 16s核糖體 RNA的 3’末端堿基AUUCCUCCACUAG（ 反 SD序列 ） 互補 ， 控制轉(zhuǎn)譯的起始 。 2. 影響 mRNA轉(zhuǎn)譯效果的因素： (1) SD序列與反 SD序列的互補程度：互補程度高 ， 則表達強 。 (2) SD序列與 AUG之間的間隔距離 (spacer)， 使用不同的啟動子 ， 表達不同的基因 ， 其最佳間隔不一樣 。 (3) –20 bp到＋ 13 bp這一段序列中不要有二級結(jié)構(gòu) （ 發(fā)卡結(jié)構(gòu) ） 。 (4) 連接在 SD序列后面的 4個堿基的改變 ， 會對轉(zhuǎn)譯效率發(fā)生很大的影響 ， 如果這個區(qū)域由 4個 A組成 ， 其轉(zhuǎn)譯作用最為有效；而當其被 4個 C或 G替代 ， 則轉(zhuǎn)譯效率僅為最高值的25~50%。 (5) 直接位于起始密碼子 AUG左側(cè)的堿基三聯(lián)體的組成 ， 對轉(zhuǎn)譯效率也有重要影響 ， 以 ?半乳糖苷酶 mRNA的轉(zhuǎn)譯為例 ， 三聯(lián)體為UAU或 CUU時 ， 轉(zhuǎn)譯最有效 ， 而若為 UUC或UCA時 ， 則轉(zhuǎn)譯水平下降 20倍 。 (6) 在起始密碼子 AUG后面的核苷酸序列對核糖體結(jié)合也有一定影響 。 3. 轉(zhuǎn)譯后的修飾與加工 在很多情況下 ， 由 mRNA轉(zhuǎn)譯成蛋白質(zhì) ，最初合成的肽鏈需經(jīng)過轉(zhuǎn)譯后的加工和修飾才能成為有活性的功能蛋白 。 在真核細胞中 ， 有時需將前體蛋白降解為功能蛋白 ， 有時需要發(fā)生某種修飾 ， 如進行糖基化變?yōu)樘堑鞍椎?。 而細菌細胞中沒有這一過程 ， 這就可能造成克隆基因在細菌中合成的功能蛋白不具有與原來完全相同的生物活性 。 克隆基因合成的蛋白質(zhì)常常遇到新的宿主細胞中蛋白酶的迅速降解 ， 尤其是短肽 。 實
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