基因工程7克隆基因的表達(dá)概述(存儲(chǔ)版)
【正文】 始 、 延長(zhǎng)和終止三個(gè)步驟 。 2. 影響 mRNA轉(zhuǎn)譯效果的因素： (1) SD序列與反 SD序列的互補(bǔ)程度：互補(bǔ)程度高 ， 則表達(dá)強(qiáng) 。 而細(xì)菌細(xì)胞中沒(méi)有這一過(guò)程 ， 這就可能造成克隆基因在細(xì)菌中合成的功能蛋白不具有與原來(lái)完全相同的生物活性 。 融合蛋白要比多數(shù)大腸桿菌的菌體蛋白大 ， 因此在蛋白質(zhì)凝膠電泳中易于鑒定 。 對(duì)于第一種情況 ， 可采用強(qiáng)啟動(dòng)子；對(duì)于第二種情況 ， 可將基因克隆到高拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體上 。 2. 若待表達(dá)的基因是化學(xué)合成的 ， 應(yīng)盡可能選擇大腸桿菌所偏愛(ài)的密碼子； 3. 使用不同的大腸桿菌宿主菌株 ， 有時(shí)可以收到意外的效果； 4. 優(yōu)化基因工程菌的培養(yǎng)條件； 5. 防止表達(dá)產(chǎn)物對(duì)宿主菌的毒害作用 ， 及時(shí)將產(chǎn)物運(yùn)到胞外可減少毒害 。 2023/4/12023/4/12023/4/12023/4/14/1/2023 ? 1他鄉(xiāng)生白發(fā)，舊國(guó)見青山。 2023/4/12023/4/12023/4/1Saturday, April 1, 2023 ? 1不知香積寺，數(shù)里入云峰。 2023/4/12023/4/12023/4/1Apr231Apr23 ? 1越是無(wú)能的人，越喜歡挑剔別人的錯(cuò)兒。 2023/4/12023/4/1April 1, 2023 ? 1一個(gè)人即使已登上頂峰，也仍要自強(qiáng)不息。 2023/4/12023/4/1Saturday, April 1, 2023 ? 閱讀一切好書如同和過(guò)去最杰出的人談話。 2023/4/12023/4/12023/4/14/1/2023 8:19:09 PM ? 1成功就是日復(fù)一日那一點(diǎn)點(diǎn)小小努力的積累。 2023/4/12023/4/12023/4/1Apr231Apr23 ? 1故人江海別，幾度隔山川。 盡管 pBR322質(zhì)粒仍然是高拷貝數(shù)的 ， 而且產(chǎn)生無(wú)質(zhì)粒細(xì)胞的幾率也極小 ，但在某些特定條件下 ， 如營(yíng)養(yǎng)缺乏或是寄主細(xì)胞快速生長(zhǎng)期間 ， 也有可能產(chǎn)生出無(wú)質(zhì)粒的細(xì)胞 。 提高克隆基因表達(dá)效率的途徑之一 ， 是增加相應(yīng)的 mRNA分子的數(shù)量 。 注意 ， 該方法的前提是多肽中無(wú) Met。 3. 轉(zhuǎn)譯后的修飾與加工 在很多情況下 ， 由 mRNA轉(zhuǎn)譯成蛋白質(zhì) ，最初合成的肽鏈需經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)譯后的加工和修飾才能成為有活性的功能蛋白 。 它以不同長(zhǎng)度 （ 3~9個(gè) bp） 組成 ， 包含5’UAAGGAGGU3’的全部或其中的一部分 ，位于 mRNA 5’末端不轉(zhuǎn)譯的前導(dǎo)區(qū)段內(nèi) ， 其起點(diǎn)距轉(zhuǎn)譯起始密碼子 AUG約 3~11個(gè)堿基 。 轉(zhuǎn)錄終止區(qū)的存在 ， 可使上述這幾種不利的現(xiàn)象得以避免 。 目前已檢測(cè)了 20多種終止序列 ， 一般特性為： (1) 有一個(gè)逆向重復(fù)的堿基序列 ， 可表示為：ABCDEFXYZF’E’D’C’B’A’， 其中 A和 A’，B和 B’等均為互補(bǔ)堿基對(duì) ， 故可發(fā)生鏈內(nèi)的堿基配對(duì) （ 轉(zhuǎn)錄時(shí)雙鏈解開 ） ， 在 RNA轉(zhuǎn)錄本上形成柄 環(huán) （ stem and loop） 結(jié)構(gòu) 。 (2) Ptrp：色氨酸啟動(dòng)子 ， 通常是編碼參與色氨酸生物合成過(guò)程中的幾種酶的基因簇上游序列 。 2. 真核細(xì)胞啟動(dòng)子中可以找到三個(gè)保守區(qū)： (1) 位于 ?12至 ?32 bp之間的 TATA框 ， 序列為TATAATATA， 其功能可能為 DNA雙鏈開始解開并決定轉(zhuǎn)錄的起點(diǎn)位置 。 (2) 中心約在 ?35位置的 TTGACA序列 ， 也稱為 ?35序列或識(shí)別區(qū) 。 真核生物有三種不同的 RNA， 因而其 RNA聚合酶也有三種 ， 分別參與不同類型的 RNA分子的合成 。 總體而言 ， 真核細(xì)胞作為表達(dá)宿主尚不成熟 ， 有待于進(jìn)一步發(fā)展 、 完善 。 真核細(xì)胞作宿主表達(dá)系統(tǒng)尚存在以下幾個(gè)問(wèn)題： (1) 轉(zhuǎn)化真核細(xì)胞的效率低； (2) 表達(dá)效率不夠高； (3) 細(xì)胞培養(yǎng) (動(dòng)植物 ) 工藝較復(fù)雜 ， 成本高； (4) 選擇標(biāo)記及選擇系統(tǒng)較少 。 ?亞基 (?因子 )容易同核心酶解離 ，
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