基因工程7克隆基因的表達概述-wenkub
2023-04-03 18:56:23 本頁面
【正文】 為間隙為 17 bp的啟動子功能較強 。 這兩個區(qū)域?qū)τ跊Q定啟動子的強度非常重要 ， 事實上很小的差異對啟動子指導轉錄的效率有重大影響 。 ?10序列有助于 DNA局部雙鏈解開 ， 因為 ?10序列含有較多的 AT對 ，所以雙鏈分開所需的能量較低 。 在大腸桿菌中 ， 啟動子被 RNA聚合酶的 ?因子所識別 。 ?亞基 (?因子 )容易同核心酶解離 ，其功能是使核心酶能穩(wěn)定地結合到 DNA的啟動子上 ， 故又稱為起始因子 。 影響基因表達的主要因素 轉錄 轉錄 是指遺傳信息從 DNA分子轉移到RNA分子的過程 ， 是以 DNA分子中的一條鏈（ 有意義鏈 、 轉錄鏈 ） 為模板 ， 在轉錄酶的催化下 ， 進行的一種聚合反應 。 真核細胞作宿主表達系統(tǒng)尚存在以下幾個問題： (1) 轉化真核細胞的效率低； (2) 表達效率不夠高； (3) 細胞培養(yǎng) (動植物 ) 工藝較復雜 ， 成本高； (4) 選擇標記及選擇系統(tǒng)較少 。第七章 克隆基因的表達 基因表達的含義 生物的遺傳信息是以基因的形式儲存在DNA分子上的 ， 將 DNA分子所承載的遺傳信息轉變?yōu)橛商囟ò被犴樞驑嫵傻亩嚯幕虻鞍踪|(zhì)分子的過程 ， 即為 基因的表達 (gene expression)。 總體而言 ， 真核細胞作為表達宿主尚不成熟 ， 有待于進一步發(fā)展 、 完善 。 轉錄酶即依賴于 DNA的 RNA聚合酶 。 真核生物有三種不同的 RNA， 因而其 RNA聚合酶也有三種 ， 分別參與不同類型的 RNA分子的合成 。 啟動子是一段 DNA序列 ， 常位于基因或操縱子編碼順序的上游 ， RNA聚合酶結合在上面 。 (2) 中心約在 ?35位置的 TTGACA序列 ， 也稱為 ?35序列或識別區(qū) 。 一般啟動子序列與保守序列相似程度越高 ， 啟動子就越強 。 2. 真核細胞啟動子中可以找到三個保守區(qū)： (1) 位于 ?12至 ?32 bp之間的 TATA框 ， 序列為TATAATATA， 其功能可能為 DNA雙鏈開始解開并決定轉錄的起點位置 。 真核生物的啟動子極為復雜 ， 不同啟動子之間的差異較大 。 (2) Ptrp：色氨酸啟動子 ， 通常是編碼參與色氨酸生物合成過程中的幾種酶的基因簇上游序列 。 (4) Ptac ：由 Ptrp和 PLac雜合而成 ， 啟動效果比二者均強 ， 仍可被 IPTG誘導 。 目前已檢測了 20多種終止序列 ， 一般特性為： (1) 有一個逆向重復的堿基序列 ， 可表示為：ABCDEFXYZF’E’D’C’B’A’， 其中 A和 A’，B和 B’等均為互補堿基對 ， 故可發(fā)生鏈內(nèi)的堿基配對 （ 轉錄時雙鏈解開 ） ， 在 RNA轉錄本上形成柄 環(huán) （ stem and loop） 結構 。 依賴于 ?蛋白質(zhì)的終止反應 ， 對一些調(diào)節(jié)機理而言是十分重要的 。 轉錄終止區(qū)的存在 ， 可使上述這幾種不利的現(xiàn)象得以避免 。 大腸桿菌 mRNA的核糖體結合位點是轉譯的起始密碼子及 SD序列 ， 要獲得良好的表達 ， 關鍵是起始密碼子以及 SD序列必須處在易接觸的部位 。 它以不同長度 （ 3~9個 bp） 組成 ， 包含5’UAAGGAGGU3’的全部或其中的一部分 ，位于 mRNA 5’末端不轉譯的前導區(qū)段內(nèi) ， 其起點距轉譯起始密碼子 AUG約 3~11個堿基 。 (3) –20 bp到＋ 13 bp這一段序列中不要有二級結構 （ 發(fā)卡結構 ） 。 3. 轉譯后的修飾與加工 在很多情況下 ， 由 mRNA轉譯成蛋白質(zhì) ，最初合成的肽鏈需經(jīng)過轉譯后的加工和修飾才能成為有活性的功能蛋白 。 實驗證明 ， 在細菌中真核基因以融合蛋白表達比非融合蛋白更為穩(wěn)定 。 注意 ， 該方法的前提是多肽中無 Met。 為了合成融合蛋白 ， 常采取與表達載體上編碼
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