基因工程技術(shù)概述-wenkub
2023-01-27 09:23:34 本頁(yè)面
【正文】 體 (Vector)是目的基因的運(yùn)載工具，其作用是將目的基因帶入受體細(xì)胞中，并使目的基因擴(kuò)增和表達(dá)。 ? 加保護(hù)堿基， 13個(gè)。 基因表達(dá) (gene expression)： 是指目的基因在受體細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，研究功能。 應(yīng)用： ? 克隆感興趣基因進(jìn)行序列分析，研究其組織結(jié)構(gòu)。 ? 加上想要的標(biāo)簽，如 Flag, Myc, His, HA。 ? 種類： 按來(lái)源分： 質(zhì)粒載體 (plasmid vector)、噬菌體載體 (phage vector)、 柯氏質(zhì)粒載體 (cosmid vector)、病毒載體 (virus vector ). 按作用分： 克隆載體 (cloning vector )、表達(dá)載體 (expression vector)、穿梭載體 (shuttle vector) ? 克隆載體 (cloning vector) 用于在受體細(xì)胞中進(jìn)行目的 基因擴(kuò)增 的載體?？蓪⒅亟M體 DNA導(dǎo)入適合的受體細(xì)胞，使所載荷的目的基因能夠復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯（ pCDNA3）。 ? 具有較小的分子量，較高的拷貝數(shù)，是一個(gè) 松弛型 的質(zhì)粒。 是細(xì)菌染色體外能夠自我復(fù) 制的雙鏈環(huán)狀 DNA 分子。外源基因的插入將破壞抗性基因的完整性，導(dǎo)致抗性基因 插入失活 ，這種特性可用于區(qū)分重組和非重組分子。 pFLAGCMV系列 (Sigma) TetOn/TetOff Expression Systems TetOff pTetsplice(pTetPTEN) pTetTAK PSVneo DNA分子的體外連接：方法 粘性末端：相同的粘性末端互相配對(duì)進(jìn)行連接 兩種情況： （ a） 目的基因和載體 用 同一種限制酶切割 后連接 。 堿性磷酸酶處理： 平頭末端： （ 1）增加連接酶的量 （連接酶對(duì)平末端 DNA的 Km 約高于粘性末端 DNA100倍 （ 2）在末端加上一個(gè)人工接頭，內(nèi)含有一定的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，經(jīng)酶切處理產(chǎn)生粘性末端，然后與載體連接。Sal I) 其他方法： Bgl II AGATCT TCTAGA BamH I GGATCC CCTAGG A GATCT TCTAG A G GATCC CCTAG G 連接 策略 ： 選擇連接位點(diǎn)： （ 1） HindIII粘性末端 載體自身環(huán)化，四環(huán)素失活 ,方向不確定。 DNA的純度 , 載體與目的基因的比例 。也可做 DNA修復(fù)。粘性末端、平末端、平末端上加人工接頭。 堿性磷酸酶 根據(jù) DNA重組的需要，為防止兩 DNA片段末端之間連接，經(jīng)常采用堿性磷酸酶處理，使 DNA末端的 5′ P成為 5′ OH。 ? 受體細(xì)胞的要求：必須具備使外源 DNA進(jìn)行復(fù)制的能力（提供復(fù)制所需的原料）而且還應(yīng)該能夠表達(dá)由導(dǎo)入的重組體分子所提供的某種表型特征，這樣才有利于轉(zhuǎn)化子細(xì)胞的選擇與鑒定。 ? 轉(zhuǎn)化效率： 只有很少比例的細(xì)胞有能力摻入質(zhì)粒 DNA 轉(zhuǎn)化時(shí)大約在 1000個(gè) DNA分子中，只有一個(gè) DNA分子獲得成功。 重組子的篩選： ? 根據(jù)重組體 的表型篩選 抗性基因 插入失活 ：生存或是毀滅？ α互補(bǔ)現(xiàn)象：藍(lán)白斑篩選 LacZ受體菌－編碼 β 半乳糖苷酶羧基端（ C 端）片斷 載體－編碼 β一半乳糖 苷酶氨基端（ N端）的 α肽 分解 Xgal，藍(lán)色克隆 不分解 Xgal 白色克隆 插入失活： α互補(bǔ)現(xiàn)象： 藍(lán)白斑篩選 42℃ 90s,+900ul LB,37
教學(xué)課件相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號(hào)-1