基因工程技術(shù)概述-免費(fèi)閱讀
【正文】 2023年 1月 24日星期二 上午 1時(shí) 51分 56秒 01:51: ? 1最具挑戰(zhàn)性的挑戰(zhàn)莫過于提升自我。 2023年 1月 24日星期二 1時(shí) 51分 56秒 01:51:5624 January 2023 ? 1空山新雨后，天氣晚來秋。 , January 24, 2023 ? 很多事情努力了未必有結(jié)果，但是不努力卻什么改變也沒有。 :51:5601:51Jan2324Jan23 ? 1故人江海別，幾度隔山川。低滲，細(xì)胞變的脆弱而易于裂解， EDTA螯和金屬離子，防止 DNA降解。一般每微克完整的 pBR322DNA產(chǎn)生 105107 轉(zhuǎn)化細(xì)胞 感受態(tài)菌制備 ? 感受態(tài)： 細(xì)菌細(xì)胞處于一個(gè)容易吸收外源 DNA狀態(tài)，這種狀態(tài)的細(xì)菌稱為感受態(tài)菌。目前采用的堿性磷酸酶有兩種，即來源于大腸桿菌的細(xì)菌堿性磷酸酶（ BAP）和來源于小牛腸的小牛腸堿性磷酸酶（ CIP）。但不能連接兩條單鏈 DNA分子和環(huán)化的單鏈DNA分子。 （ 2） EcoRISalI定向，一般不會(huì)有載體自身環(huán)化，四環(huán)素失活 （ 3） XbaISalI反向，不能進(jìn)行表達(dá)。 載體 易 自身環(huán)化 。 克隆載體 : PBR322 特點(diǎn)： ? 分子量小， ，便于操作。 穿梭載體 (shuttIe vector) 能在兩種不同的生物體內(nèi)復(fù)制和往來穿梭的載體 . 其可同時(shí)具有細(xì)菌質(zhì)粒的復(fù)制原點(diǎn)和真核生物可識(shí)別的 復(fù)制原點(diǎn)或酵母菌的自主復(fù)制序列（ ARS），它即能在 原核細(xì)胞中擴(kuò)增又能在真核細(xì)胞中復(fù)制和表達(dá) 。 ? 啟始及終止密碼子?；蚬こ碳夹g(shù) Jackson, Symons,and Berg (1972) – generated first rebinant DNA molecules Cohen and Boyer (1973) – produced first plasmid vector capable of being replicated within a bacterial host vectors – carriers of foreign DNA The Nobel Prize in Chemistry 1980 定義： ? 基因工程（ gene engineering） 重組 DNA技術(shù) （ rebinant DNA technique）：是指在各種酶的作用下，將細(xì)胞外的核酸片斷（目的基因）在體外與病毒、細(xì)菌或其它載體通過入工剪切、連接構(gòu)成重組 DNA分子，將其導(dǎo)入受體細(xì)胞并使之無性繁殖（稱之為 “克隆” ）和 表達(dá) ，這種有目的的應(yīng)用分子克隆技術(shù) ,人為的改造基因 ,改變生物的遺傳性狀的系列過程 ,總稱為基因工程 基因克隆 (gene cloning )： 是指目的基因與載體 DNA連接構(gòu)成的 DNA重組體在受體細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制、擴(kuò)增的技術(shù) 。 高保真聚合酶： HF, Pfu, Probest 等。主要用 于原核細(xì)胞與真核細(xì)胞之間進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移。 ? 有兩個(gè)抗性基因，便于轉(zhuǎn)化子篩選。 用 堿性磷酸酶 (能除掉 DNA5`端 P基團(tuán) ， 使 5`端帶一 OH)處理載體 ， 可防止載體自 環(huán)化 。四環(huán)素失活 （ 4）目的基因片段： Bgl II SalI，載體： BamH I SalI 反向，不能進(jìn)行表達(dá)。而且只能連接粘性末端。 CIP的比活性比 BAP高出 10倍以上，而且對熱敏感，便于加熱使其失活。 ? 氯化鈣法 ： ? 氯化鎂法： ? 電轉(zhuǎn)法： 氯化鈣 法： 原理 快速生長的細(xì)菌用低滲低濃 度(50 ~ 100mM) 的氯化鈣（ CaCl2)處理，使細(xì)胞腫脹成球形 加入質(zhì)粒后，即于細(xì)胞表面形成抗 DNAase的羥基 磷酸鈣復(fù)合
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