基因工程技術(shù)概述(完整版)
【正文】 分子。 堿性磷酸酶處理： 平頭末端： （ 1）增加連接酶的量 （連接酶對(duì)平末端 DNA的 Km 約高于粘性末端 DNA100倍 （ 2）在末端加上一個(gè)人工接頭，內(nèi)含有一定的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，經(jīng)酶切處理產(chǎn)生粘性末端，然后與載體連接。 DNA的純度 , 載體與目的基因的比例 。粘性末端、平末端、平末端上加人工接頭。 ? 受體細(xì)胞的要求：必須具備使外源 DNA進(jìn)行復(fù)制的能力（提供復(fù)制所需的原料）而且還應(yīng)該能夠表達(dá)由導(dǎo)入的重組體分子所提供的某種表型特征，這樣才有利于轉(zhuǎn)化子細(xì)胞的選擇與鑒定。 重組子的篩選： ? 根據(jù)重組體 的表型篩選 抗性基因 插入失活 ：生存或是毀滅？ α互補(bǔ)現(xiàn)象：藍(lán)白斑篩選 LacZ受體菌－編碼 β 半乳糖苷酶羧基端（ C 端）片斷 載體－編碼 β一半乳糖 苷酶氨基端（ N端）的 α肽 分解 Xgal，藍(lán)色克隆 不分解 Xgal 白色克隆 插入失活： α互補(bǔ)現(xiàn)象： 藍(lán)白斑篩選 42℃ 90s,+900ul LB,37 ℃ 45min Protocol: 3*1ml菌液 沉淀 + 6000rpm 5min 冰浴 30min 6000rpm 5min 沉淀 + +10ul 連接產(chǎn)物 +6ulPBR322 陰性對(duì)照 A+T A+T 陽(yáng)性對(duì)照 Amp Tet 冰浴 30min 陽(yáng)性克隆的鑒定： 挑菌落，小抽質(zhì)粒，電泳 菌落 PCR 94 ℃ 10 min 94 ℃ 30s 55 ℃ 40s 72 ℃ 1min 73 72 ℃ 8min 74 4 ℃ hold X 30 堿裂解法 堿裂解法 ? 原理： pH值介于 ，線形的 DNA和環(huán)狀的質(zhì)粒DNA變性，中間的氫鍵短裂，線狀 DNA變性后互相分開(kāi)，而環(huán)狀分子雙螺旋主鏈骨架彼此盤繞，互補(bǔ)兩條鏈緊密合在一起。 ? 溶液 III醋酸鉀。 2023年 1月 24日星期二 上午 1時(shí) 51分 56秒 01:51: ? 1比不了得就不比，得不到的就不要。 01:51:5601:51:5601:51Tuesday, January 24, 2023 ? 1不知香積寺，數(shù)里入云峰。 01:51:5601:51:5601:511/24/2023 1:51:56 AM ? 1越是沒(méi)有本領(lǐng)的就越加自命不凡。 上午 1時(shí) 51分 56秒 上午 1時(shí) 51分 01:51: MOMODA POWERPOINT Lorem ipsum dolor sit amet, consectetur adipiscing elit. Fusce id urna blandit, eleifend nulla ac, fringilla purus. Nulla iaculis tempor felis ut cursus. 感 謝 您 的 下 載 觀 看 專家告訴 。 01:51:5601:51:5601:51Tuesday, January 24, 2023 ? 1知人者智，自知者明。 2023年 1月 24日星期二 上午 1時(shí) 51分 56秒 01:51: ? 1楚塞三湘接，荊門九派通。 2023年 1月 上午 1時(shí) 51分 :51January 24, 2023 ? 1行動(dòng)出成果，工作出財(cái)富。 初步鑒定 后續(xù)： ? 測(cè)序確定插入序列與基因 bank報(bào)告完全一致 ? 檢測(cè)外源基因有無(wú)整合宿主細(xì)胞 ？ ? 檢測(cè)外源基因轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)？ ? 檢測(cè)外源基因蛋白水平表達(dá)？ ? 靜夜四無(wú)鄰，荒居舊業(yè)貧。環(huán)狀分子由于本身合在一起，所以復(fù)性迅速而準(zhǔn)確。 ? 感染：以病
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