基因工程技術(shù)概述-全文預(yù)覽
【正文】 氯化鈣 法： 原理 快速生長(zhǎng)的細(xì)菌用低滲低濃 度(50 ~ 100mM) 的氯化鈣（ CaCl2)處理，使細(xì)胞腫脹成球形 加入質(zhì)粒后，即于細(xì)胞表面形成抗 DNAase的羥基 磷酸鈣復(fù)合物 經(jīng) 42℃ 熱休克后，復(fù)合物被細(xì)胞吸收。 ? 感染：以病毒為載體的重組子，在體外包裝成具有感染力的病毒顆粒，通過(guò)感染受體細(xì)胞，然后整合到受體細(xì)胞基因組上。 CIP的比活性比 BAP高出 10倍以上，而且對(duì)熱敏感，便于加熱使其失活。 其他酶：末端修飾酶 末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（ terminal deoxynucleotidyl transferase） 簡(jiǎn)稱(chēng)末端轉(zhuǎn)移酶。而且只能連接粘性末端。 14℃ (不高于 16℃ )過(guò)夜 連接酶：兩種 ? DNA連接酶： 連接雙鏈中兩條 DNA鏈之間形成磷酸二酯鍵，封閉雙螺旋骨架缺口。四環(huán)素失活 （ 4）目的基因片段： Bgl II SalI，載體： BamH I SalI 反向，不能進(jìn)行表達(dá)。 Eco RⅠ Eco RⅠ Eco RⅠ 加同聚物尾： 載體與片段沒(méi)有共同的粘性末端時(shí)，可直接通過(guò)末端轉(zhuǎn)移酶分別接上 poly（ dA）和 poly（ dT），然后退火，直接轉(zhuǎn)化，分子間空缺部分可以在宿主體內(nèi)修復(fù)。 用 堿性磷酸酶 (能除掉 DNA5`端 P基團(tuán) ， 使 5`端帶一 OH)處理載體 ， 可防止載體自 環(huán)化 。 TA 克隆 A A TOPOTA ? 原核 Histag: pQE系列 (Qiagen), pET22(Novagen) GSTtag: pGEX系列 (Pharmacia) ?表達(dá)載體： 帶有調(diào)控基因表達(dá)所必需的轉(zhuǎn)錄與翻譯元件，如啟 動(dòng)子等，這些調(diào)控元件應(yīng)與宿主細(xì)胞相適應(yīng)。 ? 有兩個(gè)抗性基因，便于轉(zhuǎn)化子篩選。大多是一些抗菌素抗性基因，賦予受體細(xì)胞對(duì)某些抗生素的抗性，為轉(zhuǎn)化子選擇提供便利。主要用 于原核細(xì)胞與真核細(xì)胞之間進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移。主要由細(xì)菌質(zhì)?；蚺c其它質(zhì)粒、噬菌體及真核生物病毒的 DNA重組構(gòu)建（ PBR322）。 高保真聚合酶： HF, Pfu, Probest 等。 ? 轉(zhuǎn)入真核表達(dá)載體，導(dǎo)入細(xì)胞，研究其功能，表達(dá)調(diào)控機(jī)制等 基因工程基本 步驟 ： 分、切 目的基因 + 載體分子 轉(zhuǎn) 導(dǎo)入到合適的受體細(xì)胞（轉(zhuǎn)化） 接 構(gòu)成重組 DNA分子 篩 篩選含有重組分子的克隆 鑒 鑒定重組分子片段 基因工程流程示意圖 構(gòu)建重組分子（連接） ? 原料 ： 目的基因：研究對(duì)象 載體： 目的基因的運(yùn)載工具 工具酶： 連接酶、限制性?xún)?nèi)切酶 目的基因片段 來(lái)源 ： ? 基因組 DNA ? PCR 方法擴(kuò)增特定的目的基因片段（已知基因序列，已有其它表達(dá)或克隆構(gòu)建或從商品化的 cDNA文庫(kù)擴(kuò)增） ? 通過(guò) RTPCR 方法得到目的基因 cDNA ? 人工合成基因片段（價(jià)錢(qián)昂貴） 目的基因 來(lái)源選擇 ： ? 取決于解決什么問(wèn)題？ 基因功能研究 cDNA RTPCR 基因表達(dá)調(diào)控的研究 基因組 DNA PCR PCR： ? 引入合適的酶切位點(diǎn)，一個(gè) /兩個(gè)?；蚬こ碳夹g(shù) Jackson, Symons,and Berg (1972) – generated first
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