基因工程7克隆基因的表達(dá)概述-文庫吧在線文庫
【正文】 其功能是使核心酶能穩(wěn)定地結(jié)合到 DNA的啟動子上 ， 故又稱為起始因子 。 ?10序列有助于 DNA局部雙鏈解開 ， 因?yàn)??10序列含有較多的 AT對 ，所以雙鏈分開所需的能量較低 。 兩個(gè)保守區(qū)之間的 DNA對啟動子的功能也有影響 ， 各啟動子都需要一些最適的間隙 ， 通常認(rèn)為間隙為 17 bp的啟動子功能較強(qiáng) 。 Lac啟動子可被 IPTG誘導(dǎo) ， 加入該試劑到培養(yǎng)基后 ， 將使表達(dá)載體中 Lac啟動子下游插入的基因開始轉(zhuǎn)錄 ， 表達(dá)產(chǎn)物為包含 ?半乳糖苷酶的融合蛋白 。 通常終止信號是一小段 DNA片段 ，它的 RNA轉(zhuǎn)錄本上堿基對可自身相互配對形成柄 環(huán)結(jié)構(gòu) 。 在克隆基因的末端 ， 存在一個(gè)轉(zhuǎn)錄終止區(qū)是十分重要的 ， 這是因?yàn)椋? (1) 若干非必需的轉(zhuǎn)錄本的合成 ， 會使細(xì)胞消耗巨大的能量 ， 用于制造大批不必要的蛋白質(zhì)； (2) 在轉(zhuǎn)錄本上有可能形成一些不希望其出現(xiàn)的二級結(jié)構(gòu) ， 從而降低轉(zhuǎn)譯效率； (3) 有時(shí)會出現(xiàn)啟動子阻塞現(xiàn)象 ， 克隆基因啟動子所開始的轉(zhuǎn)錄 ， 有時(shí)會干擾另一個(gè)必要的基因或調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄 。 所謂 SD序列是由 ShineDalgarno首先提出 ，為細(xì)菌核糖體有效結(jié)合和轉(zhuǎn)譯起始所需要的序列 。 (6) 在起始密碼子 AUG后面的核苷酸序列對核糖體結(jié)合也有一定影響 。 一般融合蛋白要經(jīng)過后加工 ， 切除原核細(xì)胞序列 ， 才表現(xiàn)出活性 ，所以在多肽前設(shè)計(jì)一個(gè)特殊序列 ， 如 Met（ 甲硫氨酸 ） ， 用溴化氰裂解 ， 打斷 Met與其他氨基酸之間的肽鍵 ， 即可將原核序列切除掉 。 其他因素 1. 質(zhì)粒拷貝數(shù)及穩(wěn)定性對表達(dá)效率的影響： 細(xì)胞中的核糖體數(shù)量 ， 與任何一種mRNA分子數(shù)目相比 ， 都是大大超量的 。 而在 pBR322等質(zhì)粒中 ， 這個(gè) par區(qū)已經(jīng)缺失 ， 所以在其寄主細(xì)胞分裂時(shí) ， pBR322質(zhì)粒只能作隨機(jī)的分離 。 2023/4/12023/4/12023/4/14/1/2023 8:19:09 PM ? 1以我獨(dú)沈久，愧君相見頻。 2023/4/12023/4/1Saturday, April 1, 2023 ? 很多事情努力了未必有結(jié)果，但是不努力卻什么改變也沒有。 2023/4/12023/4/12023/4/12023/4/1 ? 楊柳散和風(fēng)，青山澹吾慮。 2023年 4月 2023/4/12023/4/12023/4/14/1/2023 ? 1業(yè)余生活要有意義，不要越軌。 2023/4/12023/4/12023/4/1Saturday, April 1, 2023 ? 1知人者智，自知者明。 2023/4/12023/4/12023/4/12023/4/14/1/2023 ? 1意志堅(jiān)強(qiáng)的人能把世界放在手中像泥塊一樣任意揉捏。 2023年 4月 1日星期六 2023/4/12023/4/12023/4/1 ? 1比不了得就不比，得不到的就不要。 要分泌表達(dá) ， 就要使用大腸桿菌的信號肽 ， 構(gòu)建分泌型質(zhì)粒 。 隨著重組體克隆基因表達(dá)水平的上升 ，寄主細(xì)胞的生長速率便相應(yīng)地下降 ， 同時(shí)形態(tài)上也會出現(xiàn)一些明顯的變化 ， 如細(xì)胞纖維化 、 脆弱性增加等 。 可將融合蛋白條帶從凝膠中切割下來 ， 凍干 ，碾成粉末 ， 即可用作抗原 。 克隆基因合成的蛋白質(zhì)常常遇到新的宿主細(xì)胞中蛋白酶的迅速降解 ， 尤其是短肽 。 (2) SD序列與 AUG之間的間隔距離 (spacer)， 使用不同的啟動子 ， 表達(dá)不同的基因 ， 其最佳間隔不一樣 。 1. 轉(zhuǎn)譯起始序列 mRNA有效地轉(zhuǎn)譯依賴于 mRNA的穩(wěn)定性及結(jié)合到核糖體上的能力 。 終止子有兩種不同的類型 ， 一種只取決于DNA的堿基順序 ， 另一種需要 ?終止蛋白質(zhì)的參與 。 PL是一種可被大腸桿菌RNA聚合酶識別的強(qiáng)啟動子 ， 該啟動子被 ? cI基因產(chǎn)物所抑制 ， 用 ? PL構(gòu)建的表達(dá)載體上結(jié)合一個(gè)溫敏型
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