基因工程7克隆基因的表達概述(已修改)
2025-03-23 18:56 本頁面
【正文】 第七章 克隆基因的表達 基因表達的含義 生物的遺傳信息是以基因的形式儲存在DNA分子上的 ， 將 DNA分子所承載的遺傳信息轉變?yōu)橛商囟ò被犴樞驑嫵傻亩嚯幕虻鞍踪|(zhì)分子的過程 ， 即為 基因的表達 (gene expression)。 基因表達的過程為： 利用各種先進的基因?qū)爰夹g及細胞培養(yǎng)方法已實現(xiàn)了外源基因在動植物及酵母等真核宿主細胞中的表達 。 利用真核細胞作宿主表達系統(tǒng)的優(yōu)點是： (1) 能識別和除去外源基因中的內(nèi)含子 ， 加工形成成熟的 mRNA， 即帶內(nèi)含子的天然基因是可以利用的； (2) 真核細胞將表達的蛋白糖基化 ， 而大腸桿菌表達的蛋白是無糖基化的 ， 糖基化對某些表達蛋白的免疫原性影響很大 。 真核細胞作宿主表達系統(tǒng)尚存在以下幾個問題： (1) 轉化真核細胞的效率低； (2) 表達效率不夠高； (3) 細胞培養(yǎng) (動植物 ) 工藝較復雜 ， 成本高； (4) 選擇標記及選擇系統(tǒng)較少 。 總體而言 ， 真核細胞作為表達宿主尚不成熟 ， 有待于進一步發(fā)展 、 完善 。 目前普遍采用原核生物作為表達宿主 ， 原核生物 (大腸桿菌 )繁殖速度快 ， 培養(yǎng)簡單 ， 因此一些用傳統(tǒng)和常規(guī)方法不能或難以大量生產(chǎn)的有生理活性的蛋白 ， 如果采用 “ 工程菌 ” 來生產(chǎn)就方便得多 。 外源基因在大腸桿菌中表達的基本條件 （ 無內(nèi)含子 ） ， 因為原核細胞中缺乏拼接加工系統(tǒng)； ，并能有效地為大腸桿菌 RNA聚合酶所識別和轉錄； mRNA必須穩(wěn)定 ， 且轉譯效率高； 。 影響基因表達的主要因素 轉錄 轉錄 是指遺傳信息從 DNA分子轉移到RNA分子的過程 ， 是以 DNA分子中的一條鏈（ 有意義鏈 、 轉錄鏈 ） 為模板 ， 在轉錄酶的催化下 ， 進行的一種聚合反應 。 轉錄酶即依賴于 DNA的 RNA聚合酶 。 大腸桿菌的 RNA 聚合酶由不同亞基(?2??’ω?)組成 ， 分子量約 46萬 。 完整的 RNA聚合酶 ， 即 ?2??’ ω ?， 稱為 全酶 (holoenzyme)；沒有 ? 亞基的 RNA 聚合酶稱為 核心酶(coreenzyme)。 ?亞基 (?因子 )容易同核心酶解離 ，其功能是使核心酶能穩(wěn)定地結合到 DNA的啟動子上 ， 故又稱為起始因子 。 真核生物有三種不同的 RNA， 因而其 RNA聚合酶也有三種 ， 分別參與不同類型的 RNA分子的合成 。 由 RNA聚合酶催化的轉錄過程可分為起始 、延長和終止三個步驟 。 啟動子 標志基因轉錄起始的位點稱 啟動子 。 在大腸桿菌中 ， 啟動子被 RNA聚合酶的 ?因子所識別 。 啟動子是一段 DNA序列 ， 常位于基因或操縱子編碼順序的上游 ， RNA聚合酶結合在上面 。 1. 原核細胞的啟動子 原核細胞的啟動子在轉錄起始點的上游有兩個高度保守的區(qū)域： (1) 位于轉錄起始點上游約 10個 bp的 ?10區(qū)域 ，TATAAT序列 (pribnow box)， 也稱 ?10序列 。?10序列的實際位置在不同的啟動子中略有變動 ， 其 不 同 堿 基 的 出 現(xiàn) 頻 率 為 ：T89A89T50A65A65T100。 ?10序列有助于 DNA局部雙鏈解開 ， 因為 ?10序列含有較多的 AT對 ，所以雙鏈分開所需的能量較低 。 (2) 中心約在 ?35位置的 TTGACA序列 ， 也稱為 ?35序列或識別區(qū) 。 各堿基出現(xiàn)的頻率為：T83T83G81A61C69A52。 ?35序列提供 RNA聚合酶識別的信號 。 這兩個區(qū)域?qū)τ跊Q定啟動子的強度非常重要 ， 事實上很小的差異對啟動子指導轉錄的效率有重大影響 。 一般啟動子序列與保守序列相似程度越高 ， 啟動子
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