【正文】 2021/11/10 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 第三章 基因工程的載體 ? 載體：攜帶外源基因進入受體細(xì)胞的工具 ? 用于基因工程的載體 ?細(xì)菌質(zhì)粒載體 ?噬菌體 λ 衍生載體 ?Cosmid載體 ?Phagemid載體 ?酵母質(zhì)粒載體 ?真核病毒載體 ?Bacmid載體 ?YAC載體 2021/11/10 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 發(fā)展概況 1. 第一階段（ 1977年前）： 天然質(zhì)粒和重組質(zhì)粒的利用，如 pSC101, colE1, pCR, pBR313和 pBR322 (1977, Bolivar et al) 2. 第二階段： 增大載體容量（降低載體長度），建立多克隆位點區(qū)和新的遺傳標(biāo)記基因。如 pUC系列載體。 ： 進一步完善載體功能以滿足基因工程克隆中的不同要求，如 M13mp系列載體，含 T3， T7， sp6啟動子載體，表達(dá)型載體及各種探針型載體。 2021/11/10 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 第三章 基因工程的載體 ? 作為基因工程載體的 基本功能 1. 運送外源基因高效轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞 2. 為外源基因提供復(fù)制能力或整合能力 3. 為外源基因的擴增或表達(dá)提供條件 2021/11/10 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 第三章 基因工程的載體 ? 作為基因工程載體必須具備的 基本條件 1. 具有對受體細(xì)胞的親緣性或親和性（可轉(zhuǎn)移性） 2. 具有與特定受體細(xì)胞相適應(yīng)的復(fù)制位點或整合位點 3. 長度盡可能小，以提高其載裝能力 4. 具有多種單一的酶切位點 5. 具有合適的選擇性標(biāo)記 2021/11/10 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 遺傳標(biāo)記基因 1. 標(biāo)記基因的作用 1）指示外源 DNA分子（載體或重組分子） 是否進入宿主細(xì)胞 這種指示可以是選擇性的（ Apr ， Tcr ， Kanr），也可以是非選擇性的（如 lacZ） 2） 指示外源 DNA分子 是否插入載體分子 形成了重組子。 * 這種指示也可以是 選擇性 的（如 TcS），也可以是 非選擇性 的（如 TcS， lacZα, GUS ），絕大多數(shù)為后者。 **有的遺傳標(biāo)記基因可以完成上述兩項作用。當(dāng)充任第一作用時，最好是選擇性標(biāo)記基因；當(dāng)完成第二作用時，目前多采用非選擇性的 —檢測性標(biāo)記基因。有的基因是不能用作選擇性標(biāo)記基因（ lacZ， GUS等）。 2021/11/10 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 2. 標(biāo)記基因的種類 1） 抗性標(biāo)記基因 （可直接用于選擇轉(zhuǎn)化子） a. 抗生素抗性基因 : Apr ， Tcr ， Cmr， Kanr， G418r，Hygr ， Neor b. 重金屬抗性基因 : Cur ， Znr ， Cd r c. 代謝抗性基因 : TK，抗除草劑基因 2） 營養(yǎng)標(biāo)記基因 （可直接用于選擇轉(zhuǎn)化子） 主要是參與氨基酸，核苷酸及其他必需營養(yǎng)物合成酶類的基因， 這類基因在酵母轉(zhuǎn)化中使用最頻繁，如 TRP1，URA3， LEU2， HIS4等。 3） 生化標(biāo)記基因 其表達(dá)產(chǎn)物可催化某些易檢測的生化反應(yīng)，如 lacZ, GUS, CAT 4） 噬菌斑 2021/11/10 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 3. 使用標(biāo)記基因注意要點 1）標(biāo)記基因與宿主細(xì)胞 2）標(biāo)記基因產(chǎn)物的作用機制 : Apr 3）標(biāo)記基因的結(jié)構(gòu)與適用范圍 : 基因啟動子 , 翻譯起始序列 , 密碼子偏愛性 4）標(biāo)記基因的結(jié)構(gòu)變化對功能的影響 : LacZ, GUS 4. 常用的遺傳標(biāo)記基因 1) 四環(huán)素抗性基因 （ Tcr） Tetracycline 可結(jié)合在核糖體 30s亞基中的一種蛋白質(zhì)分子上，抑制核糖體的轉(zhuǎn)位過程。四環(huán)素抗性基因編碼一種 399 AAs蛋白質(zhì)，與細(xì)菌細(xì)胞膜結(jié)合，阻止四環(huán)素分子進入細(xì)菌細(xì)胞。 2021/11/10 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 2) 氨芐青霉素抗性基因 （ Apr） Ampicillin可抑制細(xì)菌細(xì)胞膜上參與細(xì)胞壁合成酶類的活性。Apr抗性基因編碼一種分泌到細(xì)菌細(xì)胞周間質(zhì)的酶，催化 β —內(nèi)酰胺環(huán)的 水解 ，使氨芐青霉素失活。 3) 氯霉素抗性基因 （ Cmr） Chlorophenicol可結(jié)合在核糖體 50 S亞基上，阻止蛋白質(zhì)合成。 Cmr基因編碼氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶，使氯霉素 乙酰化 ，導(dǎo)致乙?；穆让顾夭荒芙Y(jié)合在核糖體上。 4) 卡那霉素 (Kanr), 新霉素 (Neor)和 G418抗性 (G418r)基因 Kanamycin， Neomycin和 G418均屬脫氧鏈霉胺氨基葡萄糖苷類抗生素，可結(jié)合在核糖體上阻止蛋白質(zhì)的合成。來自轉(zhuǎn)座子 Tn5和Tn903的 Kanr抗性基因均可使這類抗生素 磷酸化 ，使之不能進入細(xì)胞內(nèi)。 2021/11/10 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 5） β —半乳糖苷酶基因（ lacZ 和 lacZα ） β —半乳糖苷酶基因有 1021 AAs，基因產(chǎn)物不具酶活性，裝配為四聚體后才有酶活。該蛋白質(zhì)可分為兩部分： α 鏈和β 鏈。前者負(fù)責(zé)四聚體裝配，后者具 β —半乳糖苷酶活性；只有當(dāng)兩者都存在時，才會表現(xiàn)出酶活性，該作用稱之為 α 互補作用 。這兩個部分可獨立存在， 分別由兩個基因編碼。為 α 鏈編碼的基因稱之為 lacZα (編碼 145 AAs)。這兩個基因（ LacZ和LacZα ）均可作為標(biāo)記基因。 β —半乳糖苷酶基因的優(yōu)點 : a. 酶催化 XGal水解為蘭色產(chǎn)物，檢測直觀 b. lacZα 編碼 539。端可容許很大的變化而不影響酶活性 c. lacZα 和 β 鏈基因的分別表達(dá)可使載體小而容量大 2021/11/10 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 6） 葡萄糖苷酸酶基因（ GUS） 該基因編碼一種可分解各種 β 葡萄糖苷酸酶基因衍生物的水解酶。該標(biāo)記基因除具有上述 lacZ基因的優(yōu)點外，它的適用范圍十分廣泛，因為許多生物中沒有這種基因。 7） 熒光素酶基因 熒光素酶或由螢火蟲產(chǎn)生的可催化蜜蜂熒光素氧化的酶，并產(chǎn)生熒光，