【正文】 3) 病毒型復(fù)制起點：高拷貝 2. 標(biāo)記基因與拷貝數(shù)的關(guān)系 若標(biāo)記基因表達(dá)效率高 ， 宿主細(xì)胞可能不大量產(chǎn)生標(biāo)記基因以滿足選擇壓力要求 ， 因而載體拷貝數(shù)會降低 。 2021/11/10 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 分子克隆載體的復(fù)制起點與種類 1. 復(fù)制起點的種類 1) 核內(nèi)復(fù)制起點 a. 染色體復(fù)制起點 —原核生物 (環(huán)狀 )和真核生物 (線狀 )染色體 b. 染色體外復(fù)制起點 i. 質(zhì)粒 —DNA,RNA,線狀 ,環(huán)狀 ,單鏈 ,雙鏈 ii. 病毒 —同上 , 細(xì)胞內(nèi)和病毒顆粒內(nèi) 2) 核外復(fù)制起點 a. 線粒體 —所有真核細(xì)胞 b. 葉綠體 —所有綠色植物細(xì)胞 原核與真核生物 兩種質(zhì)體中亦可能含有質(zhì)粒 2021/11/10 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 3. 按復(fù)制起點劃分克隆載體 1) 質(zhì)粒復(fù)制型 —復(fù)制起點來自質(zhì)?；蚓€粒體和葉綠體 2) ARS復(fù)制型 —ARS（ autonomus replicative sequence)，或稱染色體復(fù)制型 3) 病毒復(fù)制型 —復(fù)制起點來自病毒，若為 RNA病毒，必須反轉(zhuǎn)錄為 cDNA。 7） 熒光素酶基因 熒光素酶或由螢火蟲產(chǎn)生的可催化蜜蜂熒光素氧化的酶，并產(chǎn)生熒光，若在反應(yīng)中加入 CoA，可使靈敏度提高 10倍；或由發(fā)光細(xì)菌（ Photobacterium fischeri）產(chǎn)生的熒光素酶，它與 FMN氧化還原酶聯(lián)用，通過 NAD(P)H的變化測定酶活 。端可容許很大的變化而不影響酶活性 c. lacZα 和 β 鏈基因的分別表達(dá)可使載體小而容量大 2021/11/10 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 6） 葡萄糖苷酸酶基因（ GUS） 該基因編碼一種可分解各種 β 葡萄糖苷酸酶基因衍生物的水解酶。這兩個基因（ LacZ和LacZα ）均可作為標(biāo)記基因。這兩個部分可獨立存在， 分別由兩個基因編碼。該蛋白質(zhì)可分為兩部分： α 鏈和β 鏈。來自轉(zhuǎn)座子 Tn5和Tn903的 Kanr抗性基因均可使這類抗生素 磷酸化 ，使之不能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。 Cmr基因編碼氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶，使氯霉素 乙?；?，導(dǎo)致乙酰化的氯霉素不能結(jié)合在核糖體上。Apr抗性基因編碼一種分泌到細(xì)菌細(xì)胞周間質(zhì)的酶，催化 β —內(nèi)酰胺環(huán)的 水解 ，使氨芐青霉素失活。四環(huán)素抗性基因編碼一種 399 AAs蛋白質(zhì)，與細(xì)菌細(xì)胞膜結(jié)合，阻止四環(huán)素分子進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞。 2021/11/10 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 2. 標(biāo)記基因的種類 1） 抗性標(biāo)記基因 （可直接用于選擇轉(zhuǎn)化子） a. 抗生素抗性基因 : Apr ， Tcr ， Cmr， Kanr， G418r，Hygr ， Neor b. 重金屬抗性基因 : Cur ， Znr ， Cd r c. 代謝抗性基因 : TK，抗除草劑基因 2） 營養(yǎng)標(biāo)記基因 （可直接用于選擇轉(zhuǎn)化子） 主要是參與氨基酸，核苷酸及其他必需營養(yǎng)物合成酶類的基因， 這類基因在酵母轉(zhuǎn)化中使用最頻繁，如 TRP1，URA3， LEU2， HIS4等。當(dāng)充任第一作用時，最好是選擇性標(biāo)記基因；當(dāng)完成第二作用時，目前多采用非選擇性的 —檢測性標(biāo)記基因。 * 這種指示也可以是 選擇性 的（如 TcS），也可以是 非選擇性 的（如 TcS， lacZα, GUS ），絕大多數(shù)為后者。 ： 進(jìn)一步完善載體功能以滿足基因工程克隆中的不同要求，如 M13mp系列載體，含 T3， T7， sp6啟動子載體，表達(dá)型載體及各種探針型載體。2021/11/10 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 第三章 基因工程的載體 ? 載體：攜帶外源基因進(jìn)入受體細(xì)胞的工具 ? 用于基因工程的載體 ?細(xì)菌質(zhì)粒載體 ?噬菌體 λ 衍生載體 ?Cosmid載體 ?Phagemid載體 ?酵母質(zhì)粒載體 ?真核病毒載體 ?Bacmid載體 ?YAC載體 2021/11/10 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 發(fā)展概況 1. 第一階段（ 1977年前）： 天然質(zhì)粒和重組質(zhì)粒的利用，如 pSC101, colE1, pCR, pBR313和 pBR322 (1977, Bolivar et al) 2. 第二階段： 增大載體容量（降低載體長度），建立多克隆位點區(qū)和新的遺傳標(biāo)記基因。如 pUC系列載體。 2021/11/10 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 第三章 基因工程的載體 ? 作為基因工程載體的 基本功能 1. 運送外源基因高效轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞 2. 為外源基因提供復(fù)制能力或整合能力 3. 為外源基因的擴(kuò)增或表達(dá)提供條件 2021/11/10 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 第三章 基因工程的載體 ? 作為基因工程載體必須具備的 基本條件 1. 具有對受體細(xì)胞的親緣性或親和性（可轉(zhuǎn)移性） 2. 具有與特定受體細(xì)胞相適應(yīng)的復(fù)制位點或整合位點 3. 長度盡可能小，以提高其載裝能力 4. 具有多種單一的酶切位點 5. 具有合適的選擇性標(biāo)記 2021/11/10 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 遺傳標(biāo)記基因 1. 標(biāo)記基因的作用 1）指示外源 DNA分子（載體或重組分子） 是否進(jìn)入宿主細(xì)胞 這種指示可以是選擇性的（ Apr ， Tcr ， Kanr），也可以是非選擇性的（如 lacZ） 2） 指示外源 DNA分子 是否插入載體分子 形成了重組子。 **有的遺傳標(biāo)記基因可以完成上述兩項作用。有的基因是不能用作選擇性標(biāo)記基因（ lacZ， GUS等）。 3） 生化標(biāo)記基因 其表達(dá)產(chǎn)物可催化某些易檢測的生化反應(yīng)，如 lacZ, GUS, CAT 4） 噬菌斑 2021/11/10 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 3. 使用標(biāo)記基因注意要點 1）標(biāo)記基因與宿主細(xì)胞 2）標(biāo)記基因產(chǎn)物的作用機(jī)制 : Apr 3）標(biāo)記基因的結(jié)構(gòu)與適用范圍 : 基因啟動子 , 翻譯起始序列 , 密碼子偏愛性