【文章內容簡介】 質粒載體 二、質粒（ plasmid）載體的構建 理想質粒載體所具備的條件 ? 質粒較小 ? 質粒帶有可供選擇的標記 ? 帶有盡可能多的單一限制酶切位點 ? 應有較高的基因表達能力 2021/11/10 蘇州科技學院生物系 葉亞新 第一節(jié) 質粒載體 二、質粒（ plasmid）載體的構建 質粒人工構建的目的 ? 天然質粒往往存在著這樣或那樣的缺陷，因而不適合用作基因工程的載體必須對之進行改造構建： （ 1） 加入合適的選擇標記基因 ，如兩個以上，易于用作選擇 （ 2） 增加或減少合適的酶切位點 ，便于重組 （ 3） 縮短長度 ，切去不必要的片段，提高導入效率， 增加裝載量 （ 4） 改變復制子，變嚴緊為松弛，變少拷貝為多拷貝 （ 5）根據(jù)基因工程的特殊要求 加裝特殊的基因元件 方法就是重組，拼拼接接，挖肉補瘡。 2021/11/10 蘇州科技學院生物系 葉亞新 1. 多拷貝質粒 經(jīng)過人工突變，除去控制拷貝數(shù)負調節(jié)基因，使質?？截悢?shù)達到每個細胞數(shù)千，用于擴增外源基因。 2. 測序質粒 拷貝數(shù)高，加裝測定順序所必需的序列，如多切口接頭，便于各種片段方便克隆 3. 整合質粒 裝有整合促進基因及整合特異序列，便于外源基因準確重組整合入受體細胞的染色體上 4. 穿梭質粒 含有兩個不同的復制子，能在兩種不同的受體細胞中復制 5. 表達質粒 裝有強的啟動基因，合適的順序以及有效的終止子，以便任何外源基因在受體細胞內的高效表達 6. 探針質粒 篩選克隆或尋找基因元件，他通常裝有一個可以定量測定其表達的標記基因，如抗性基因。篩選啟動基因、終止子等。 人工構建的質粒根據(jù)其功能及用途分為： 2021/11/10 蘇州科技學院生物系 葉亞新 第一節(jié) 質粒載體 二、質粒（ plasmid）載體的構建 人工組建克隆載體 pBR322 ? 大?。? kb ? 選擇標記： Apr Tcr ? 單一酶切位點： EcoRⅠ HindⅢ BamHⅠ PstⅠ I SalⅠ 等 2021/11/10 蘇州科技學院生物系 葉亞新 第一節(jié) 質粒載體 二、質粒（ plasmid）載體的構建 人工組建克隆載體 pBR322 ? 用于組建 pBR322的 三個親本質粒 的特征： ? pSE2124： Apr基因 ? pMB8 :Col EI松弛型復制子 ? pSC101:Tcr基因 2021/11/10 蘇州科技學院生物系 葉亞新 2021/11/10 蘇州科技學院生物系 葉亞新 第一節(jié) 質粒載體 二、質粒（ plasmid）載體的構建 人工組建克隆載體 pUC系列質粒 ? 多拷貝大腸桿菌型質粒，包括 pUC8/9 pUC18/19 ? pUC的親本質粒是 pBR322,包括如下四個部分： ? 來自 pBR322 的復制起點（ ori） ? 來自 pBR322的 Apr基因（核甘酸序列已發(fā)生改變） ? lacZ基因及其啟動子組成 lacZ‘ 基因 ? lacZ‘ 內部人工組裝了一個多克隆位點（ MCS） 它含有如下單一酶切口： EcoRI、 SstI、 KpnI、 SmaI、BamHI、 XbalI、 PstI、 SphI、 HindIII。 2021/11/10 蘇州科技學院生物系 葉亞新 第一節(jié) 質粒載體 二、質粒（ plasmid）載體的構建 人工組建克隆載體 pUC系列質粒 ? pUC系列質粒的優(yōu)點 ? 更小的相對分子量和更高的拷貝數(shù) ? 可用組織化學法檢測重組體 ? 具有多克隆位點（ MCS）區(qū)段 是基因工程中目前最常用的 2021/11/10 蘇州科技學院生物系 葉亞新 第一節(jié) 質粒載體 三、質粒（ plasmid）的制備 1. 堿裂解法 （ 1）將菌體懸浮在含有 EDTA的緩沖液體中 （ 2）加溶菌酶裂解細菌細胞壁 （ 3）加 NaOH與 SDS的混合溶液，去膜釋放內含物 （ 4）加高濃度的醋酸鉀溶液沉淀染色體，去除染色體 DNA及大部分蛋白質 （ 5）離心取上清液，用苯酚－氯仿溶液處理，滅活去除痕量蛋白質及核酸酶 （ 6）乙醇或異丙醇沉淀水相質粒 （ 7）無 DNase的 RNase處理殘余 RNA 2021/11/10 蘇州科技學院生物系 葉亞新 第一節(jié) 質粒載體 三、質粒（ plasmid）的制備 2. 沸水浴法 （ 1）將菌體懸浮在含有 EDTA和 Triton X100的緩沖液中 （ 2）加溶菌酶破細胞壁 （ 3）放入沸水浴中煮 40秒 （ 4）離心，用無菌牙簽挑去沉淀物 （ 5）乙醇異丙醇沉淀 2021/11/10 蘇州科技學院生物系 葉亞新 一、 Ti質粒載體 1. 根癌農(nóng)桿菌 (Agrobacterium tumefaciens)與 Ti質粒 G菌，可侵入 90科雙子葉植物受傷組織，形成冠癭瘤 (crown gall tumor)。冠癭瘤細胞具有以下特征： i. 不需要補充植物激素便可進行離體培養(yǎng) —冠癭堿 (opine)，能專一 的為根癌農(nóng)桿菌所利用 . 這兩個特征由 Ti質粒決定，但該質粒中僅有一部分進入植物細胞。 三、其他質粒載體 2021/11/10 蘇州科技學院生物系 葉亞新 二、 釀酒酵母 (Saccharomycea cerevisiae)的分子克隆載體 1) 按復制方式劃分 i. 自主復制型； ii. 整合型（非自主復制型） Yeast Integration plasmid(YIp) 2)按復制子來源劃分 i. 附加體型 yeast episomal plasmid(YEp)，其復制起點來自于釀酒酵母的天然質粒 2μ質粒 ii. 染色體復制型 Yeast Replicating plasmid(YRp)，其復制起點來自染色體上的自主復制序列 (ARSautonomous replicating sequence) 三、其他質粒載體 2021/11/10 蘇州科技學院生物系 葉亞新 4. pYAC載體 酵母菌人工染色體 (yeast