【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 質(zhì)粒載體 二、質(zhì)粒（ plasmid）載體的構(gòu)建 理想質(zhì)粒載體所具備的條件 ? 質(zhì)粒較小 ? 質(zhì)粒帶有可供選擇的標(biāo)記 ? 帶有盡可能多的單一限制酶切位點(diǎn) ? 應(yīng)有較高的基因表達(dá)能力 2021/11/10 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 第一節(jié) 質(zhì)粒載體 二、質(zhì)粒（ plasmid）載體的構(gòu)建 質(zhì)粒人工構(gòu)建的目的 ? 天然質(zhì)粒往往存在著這樣或那樣的缺陷，因而不適合用作基因工程的載體必須對(duì)之進(jìn)行改造構(gòu)建： （ 1） 加入合適的選擇標(biāo)記基因 ，如兩個(gè)以上，易于用作選擇 （ 2） 增加或減少合適的酶切位點(diǎn) ，便于重組 （ 3） 縮短長(zhǎng)度 ，切去不必要的片段，提高導(dǎo)入效率， 增加裝載量 （ 4） 改變復(fù)制子，變嚴(yán)緊為松弛，變少拷貝為多拷貝 （ 5）根據(jù)基因工程的特殊要求 加裝特殊的基因元件 方法就是重組，拼拼接接，挖肉補(bǔ)瘡。 2021/11/10 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 1. 多拷貝質(zhì)粒 經(jīng)過人工突變，除去控制拷貝數(shù)負(fù)調(diào)節(jié)基因，使質(zhì)?？截悢?shù)達(dá)到每個(gè)細(xì)胞數(shù)千，用于擴(kuò)增外源基因。 2. 測(cè)序質(zhì)粒 拷貝數(shù)高，加裝測(cè)定順序所必需的序列，如多切口接頭，便于各種片段方便克隆 3. 整合質(zhì)粒 裝有整合促進(jìn)基因及整合特異序列，便于外源基因準(zhǔn)確重組整合入受體細(xì)胞的染色體上 4. 穿梭質(zhì)粒 含有兩個(gè)不同的復(fù)制子，能在兩種不同的受體細(xì)胞中復(fù)制 5. 表達(dá)質(zhì)粒 裝有強(qiáng)的啟動(dòng)基因，合適的順序以及有效的終止子，以便任何外源基因在受體細(xì)胞內(nèi)的高效表達(dá) 6. 探針質(zhì)粒 篩選克隆或?qū)ふ一蛟ǔＱb有一個(gè)可以定量測(cè)定其表達(dá)的標(biāo)記基因，如抗性基因。篩選啟動(dòng)基因、終止子等。 人工構(gòu)建的質(zhì)粒根據(jù)其功能及用途分為： 2021/11/10 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 第一節(jié) 質(zhì)粒載體 二、質(zhì)粒（ plasmid）載體的構(gòu)建 人工組建克隆載體 pBR322 ? 大?。? kb ? 選擇標(biāo)記： Apr Tcr ? 單一酶切位點(diǎn)： EcoRⅠ HindⅢ BamHⅠ PstⅠ I SalⅠ 等 2021/11/10 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 第一節(jié) 質(zhì)粒載體 二、質(zhì)粒（ plasmid）載體的構(gòu)建 人工組建克隆載體 pBR322 ? 用于組建 pBR322的 三個(gè)親本質(zhì)粒 的特征： ? pSE2124： Apr基因 ? pMB8 :Col EI松弛型復(fù)制子 ? pSC101:Tcr基因 2021/11/10 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 2021/11/10 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 第一節(jié) 質(zhì)粒載體 二、質(zhì)粒（ plasmid）載體的構(gòu)建 人工組建克隆載體 pUC系列質(zhì)粒 ? 多拷貝大腸桿菌型質(zhì)粒，包括 pUC8/9 pUC18/19 ? pUC的親本質(zhì)粒是 pBR322,包括如下四個(gè)部分： ? 來自 pBR322 的復(fù)制起點(diǎn)（ ori） ? 來自 pBR322的 Apr基因（核甘酸序列已發(fā)生改變） ? lacZ基因及其啟動(dòng)子組成 lacZ‘ 基因 ? lacZ‘ 內(nèi)部人工組裝了一個(gè)多克隆位點(diǎn)（ MCS） 它含有如下單一酶切口： EcoRI、 SstI、 KpnI、 SmaI、BamHI、 XbalI、 PstI、 SphI、 HindIII。 2021/11/10 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 第一節(jié) 質(zhì)粒載體 二、質(zhì)粒（ plasmid）載體的構(gòu)建 人工組建克隆載體 pUC系列質(zhì)粒 ? pUC系列質(zhì)粒的優(yōu)點(diǎn) ? 更小的相對(duì)分子量和更高的拷貝數(shù) ? 可用組織化學(xué)法檢測(cè)重組體 ? 具有多克隆位點(diǎn)（ MCS）區(qū)段 是基因工程中目前最常用的 2021/11/10 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 第一節(jié) 質(zhì)粒載體 三、質(zhì)粒（ plasmid）的制備 1. 堿裂解法 （ 1）將菌體懸浮在含有 EDTA的緩沖液體中 （ 2）加溶菌酶裂解細(xì)菌細(xì)胞壁 （ 3）加 NaOH與 SDS的混合溶液，去膜釋放內(nèi)含物 （ 4）加高濃度的醋酸鉀溶液沉淀染色體，去除染色體 DNA及大部分蛋白質(zhì) （ 5）離心取上清液，用苯酚－氯仿溶液處理，滅活去除痕量蛋白質(zhì)及核酸酶 （ 6）乙醇或異丙醇沉淀水相質(zhì)粒 （ 7）無 DNase的 RNase處理殘余 RNA 2021/11/10 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 第一節(jié) 質(zhì)粒載體 三、質(zhì)粒（ plasmid）的制備 2. 沸水浴法 （ 1）將菌體懸浮在含有 EDTA和 Triton X100的緩沖液中 （ 2）加溶菌酶破細(xì)胞壁 （ 3）放入沸水浴中煮 40秒 （ 4）離心，用無菌牙簽挑去沉淀物 （ 5）乙醇異丙醇沉淀 2021/11/10 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 一、 Ti質(zhì)粒載體 1. 根癌農(nóng)桿菌 (Agrobacterium tumefaciens)與 Ti質(zhì)粒 G菌，可侵入 90科雙子葉植物受傷組織，形成冠癭瘤 (crown gall tumor)。冠癭瘤細(xì)胞具有以下特征： i. 不需要補(bǔ)充植物激素便可進(jìn)行離體培養(yǎng) —冠癭堿 (opine)，能專一 的為根癌農(nóng)桿菌所利用 . 這兩個(gè)特征由 Ti質(zhì)粒決定，但該質(zhì)粒中僅有一部分進(jìn)入植物細(xì)胞。 三、其他質(zhì)粒載體 2021/11/10 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 二、 釀酒酵母 (Saccharomycea cerevisiae)的分子克隆載體 1) 按復(fù)制方式劃分 i. 自主復(fù)制型； ii. 整合型（非自主復(fù)制型） Yeast Integration plasmid(YIp) 2)按復(fù)制子來源劃分 i. 附加體型 yeast episomal plasmid(YEp)，其復(fù)制起點(diǎn)來自于釀酒酵母的天然質(zhì)粒 2μ質(zhì)粒 ii. 染色體復(fù)制型 Yeast Replicating plasmid(YRp)，其復(fù)制起點(diǎn)來自染色體上的自主復(fù)制序列 (ARSautonomous replicating sequence) 三、其他質(zhì)粒載體 2021/11/10 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 4. pYAC載體 酵母菌人工染色體 (yeast