【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 涵體的復(fù)性與重折疊（ refolding）： 二硫鍵形成 在包涵體變性體系中，始終存在著還原劑，使多肽鏈中的巰基保持還原狀態(tài)，防 化學(xué)氧化法（ A） 需要電子受體，最廉價(jià)的電子受體為空氣，二硫鍵形成是 二硫鍵交換（ B） 需要還原型和氧化型谷胱甘肽（ GSH和 GSSG）， 二硫鍵 止二硫鍵錯(cuò)配導(dǎo)致嚴(yán)重的集聚。在變性操作結(jié)束后，這些游離型的巰基必須重新 配對(duì)形成二硫鍵，此時(shí)多肽鏈也重新發(fā)生折疊。形成二硫鍵的方式主要有： 隨機(jī)的，僅適用于那些不含游離半胱氨酸殘基的蛋白質(zhì)的重折疊 形成相對(duì)特異，因此適用性較廣，重折疊效果好 HS HS S S + 2e + 2H+ A HS HS SSR HS + B RSSR S S 2RSH 分泌型異源蛋白的表達(dá) 在大腸桿菌中表達(dá)的異源蛋白按其在細(xì)胞中的定位可分為兩種形式：即以可溶性或不溶性（包涵體）狀態(tài)存在于細(xì)胞質(zhì)中；或者通過運(yùn)輸或分泌方式定位于細(xì)胞周質(zhì)，甚至穿過外膜進(jìn)入培養(yǎng)基中。蛋白產(chǎn)物 N端 信號(hào)肽 序列的存在是蛋白質(zhì)分泌的前提條件 分泌型異源蛋白的表達(dá) 以分泌形式表達(dá)目的蛋白的優(yōu)缺點(diǎn) 分泌表達(dá)形式的優(yōu)點(diǎn)： 目的蛋白穩(wěn)定性高 重組人胰島素原若分泌到細(xì)胞周中，其穩(wěn) 穩(wěn)定性大約是在細(xì)胞質(zhì)中的 10倍 目的蛋白易于分離 目的蛋白末端完整 相當(dāng)多的真核生物成熟蛋白 N端并不含有 甲硫氨酸殘基。當(dāng)這些真核基因在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)，蛋白質(zhì) N端的甲硫氨酸殘基往往不能被切除。如若將外源基因與大腸 桿菌的 信號(hào)肽編碼序列重組在一起，一旦分泌型表達(dá)，其 N端 的甲硫氨酸殘基便可在信號(hào)肽的剪切過程中被有效除去 分泌型異源蛋白的表達(dá) 以分泌形式表達(dá)目的蛋白的優(yōu)缺點(diǎn) 分泌表達(dá)形式的缺點(diǎn)： 相對(duì)其它生物細(xì)胞而言，大腸桿菌的蛋白分泌機(jī)制并不健全。外源真核生物基因很難在大腸桿菌中進(jìn)行分泌型表達(dá)，少數(shù)外源基因既便能分泌表達(dá)，但其表達(dá)率通常要比包涵體方式低很多，因此目前用于產(chǎn)業(yè)化的異源蛋白分泌型重組大腸桿菌盡管有，但并不普遍 分泌型異源蛋白的表達(dá) 蛋白質(zhì)的分泌機(jī)制 原核細(xì)菌周質(zhì)中含有多種 分子伴侶 可阻止分泌蛋白的隨機(jī)折疊 ， 分泌在細(xì)胞周質(zhì)或培養(yǎng)基中的重組蛋白很少形成分子間的二硫鍵交聯(lián)，因此與包涵體相比，分泌型重組蛋白具有較高比例的正確構(gòu)象，生物活性的回收率增加，且對(duì)蛋白酶不敏感 分泌型異源蛋白的表達(dá) 分泌型目的蛋白表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建 包括大腸桿菌在內(nèi)的絕大多數(shù)革蘭氏陰性菌不能將蛋白質(zhì)直接分 泌到胞外，但有些革蘭氏陰性菌能將細(xì)菌的抗菌蛋白（細(xì)菌素）分泌 到培養(yǎng)基中，這一過程嚴(yán)格依賴于細(xì)菌素釋放蛋白，它激活定位于內(nèi) 上的磷酸酯酶 ，導(dǎo)致細(xì)菌內(nèi)外膜的通透性增大。 因此，只要將細(xì)菌素釋放蛋白編碼基因克隆在一個(gè)合適的質(zhì)粒上 即可構(gòu)建完全分泌型的受體細(xì)胞。此時(shí)，用另一種攜帶大腸桿菌信號(hào) 肽編碼序列和目的基因的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化上述完全分泌型受體細(xì)胞，并 使用相同性質(zhì)的啟動(dòng)子介導(dǎo)目的基因的轉(zhuǎn)錄，則可實(shí)現(xiàn)目的蛋白從重 組大腸桿菌中的完全分泌。 融合型異源蛋白的表達(dá) 除了直接表達(dá)異源蛋白外，還可將外源基因與受體菌自身的蛋白質(zhì)編碼基因拼接在一起，并作為一個(gè)開放型 閱讀框架 進(jìn)行表達(dá)。由這種雜合基因表達(dá)出的蛋白質(zhì)稱為 融合蛋白 。在這種融合蛋白結(jié)構(gòu)中，通常受體細(xì)菌的蛋白部分位于 N端，異源蛋白位于 C端。通過在 DNA水平上人工設(shè)計(jì)引入的蛋白酶切割位點(diǎn)或化學(xué)試劑特異性斷裂位點(diǎn)，可以在體外從純化的融合蛋白分子中釋放回收異源蛋白 融合型異源蛋白的表達(dá) 以融合形式表達(dá)目的蛋白的優(yōu)缺點(diǎn) 目的蛋白穩(wěn)定性高 尤其對(duì)分子量較小的多肽效果更佳 目的蛋白易于分離 利用受體蛋白成熟的抗體、配體、底物進(jìn) 目的蛋白表達(dá)率高 與受體蛋白共用一套完善的表達(dá)元件 胞內(nèi)形成良好的空間構(gòu)象，且大多具有水溶性 目的蛋白。在實(shí)際生產(chǎn)中，產(chǎn)品主要的成本往往就在該工段 行親和層析，可以快速獲得純度較高的融合蛋白 目的蛋白溶解性好 由于受體蛋白的存在，融合蛋白往往能在 目的蛋白需要回收 融合蛋白需要裂解和進(jìn)一步分離，才能獲 融合型異源蛋白的表達(dá) 融合型目的蛋白表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建 融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建原則： 受體細(xì)胞的結(jié)構(gòu)基因能高效表達(dá)，且其表達(dá)產(chǎn)物可以通過親和 層析進(jìn)行特異性簡(jiǎn)單純化 兩個(gè)結(jié)構(gòu)基因拼接位點(diǎn)處的序列設(shè)計(jì)十分重要，它直接決定著 為目的蛋白分離回收創(chuàng)造條件 外源基因應(yīng)裝在受體蛋白編碼基因的下游，為融合蛋白提供終 止密碼子。在某些情況下，并不需要完整的受體結(jié)構(gòu)基因，目 的是盡可能避免融合蛋白分子中兩種組份的分子量過于接近， 融合蛋白的裂解工藝 兩個(gè)蛋白編碼序列應(yīng)保持一致的翻譯閱讀框架 融合型異源蛋白的表達(dá) 融合型目的蛋白表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建 用于融合蛋白構(gòu)建的受體蛋白： 谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（ GST） 維持良好空間構(gòu)象 硫氧化還原蛋白（ TrxA） 維持良好空間構(gòu)象 pTrxFus 麥芽糖結(jié)合蛋白（ MBP） 促進(jìn)分泌 金黃色葡萄球菌蛋白 A（ SAPA） 免疫親和層析 pRIT2T 外膜蛋白（ OmpF） 促進(jìn)分泌 b半乳糖苷酶（ LacZ） 免疫親和層析 泛素蛋白（ Ubi） 維持良好空間構(gòu)象 融合型異源蛋白的表達(dá) 目的蛋白的回收 融合蛋白中受體蛋白部分的存在可能會(huì)影響目的蛋白的空間構(gòu)象和生物活性，如果將之注入人體還會(huì)導(dǎo)致免疫反應(yīng)，因此在制備和生產(chǎn)藥用目的蛋白時(shí)，將融合蛋白中的受體蛋白部分完整除去是必不可少的工序。融合蛋白的位點(diǎn)專一性斷裂方法有兩種： 化學(xué)斷裂法 酶促裂解法 融合型異源蛋白的表達(dá) 目的蛋白的回收 用于蛋白位點(diǎn)專一性化學(xué)斷裂的最佳試劑為 溴化氰 （ CNBr）它與多肽鏈中的 甲硫氨酸 殘基側(cè)鏈的 硫醚基 反應(yīng)，生成溴化亞氨內(nèi)酯，后者不穩(wěn)定，在水的作用下肽鍵斷裂，形成兩個(gè)多肽降解片段其中 上游肽段 的甲硫氨酸殘基轉(zhuǎn)化為 高絲氨酸 殘基，而下游肽段 N端的第一位氨基酸殘基保持不變。這一方法的優(yōu)點(diǎn)是回收率高（可達(dá)到 85%以上），專一性強(qiáng)，而且所產(chǎn)生的目的蛋白的 N端不含甲硫氨酸，與真核生物細(xì)胞中的成熟表達(dá)產(chǎn)物較為接近。然而，如果異源蛋白分子內(nèi)部含有甲硫氨酸殘基，則不能用此方法 化學(xué)斷裂法： 融合型異源蛋白的表達(dá) 目的蛋白的回收 酶促裂解法： 單殘基位點(diǎn) 蛋白內(nèi)切酶 切割位點(diǎn) 梭菌蛋白酶 ArgC 葡萄球菌蛋白酶 GluC 假單孢菌蛋白酶 LysC 豬胰蛋白酶 ArgC LysC 蛋白酶酶促裂解法的特點(diǎn)是斷裂效率更高， 同時(shí)每種蛋白酶均具有相應(yīng)的 斷裂位點(diǎn)決定 簇 ，因此可供選擇的專一性斷裂位點(diǎn)范圍較 廣。幾種斷裂位點(diǎn)專一性最強(qiáng)的商品化蛋白 酶分別在多肽鏈中的 精氨酸 、 谷氨酸、賴氨 酸 殘基處切開酰胺鍵，形成不含上述殘基的 下游斷裂肽段，與溴化氰化學(xué)斷裂法相似。 用上述蛋白酶裂解融合蛋白的前提條件是外 源蛋白分子內(nèi)部不能含有精氨酸、谷氨酸或 賴氨酸殘基，如果外源基因表達(dá)產(chǎn)物為小分子多肽，這一限制條件并不苛刻，但 大分子量的異源蛋白來說，上述三種氨基酸殘基的出現(xiàn)頻率是相當(dāng)高的 Arg C N N C 受體蛋白 目的蛋白 融合型異源蛋白的表達(dá) 目的蛋白的回收 酶促裂解法： 多殘基位點(diǎn) 為了克服僅切單一氨基酸殘基的蛋白酶所帶來的應(yīng)用局限性，可在受體蛋白編碼序列與不含起始密碼子的外源基因之間加裝一段編碼 寡肽序列 （ IleGluGlyArg） 的人工接頭片段，該寡肽為具有蛋白酶活性的 凝血因子 Xa的識(shí)別和作用序列，其斷裂位點(diǎn)在 Arg的C末端 。純化后的融合蛋白用 Xa處理，即可獲得不含上述寡肽序列的目的蛋白。由于 Xa的識(shí)別作用序列由四個(gè)氨基酸殘基組成，大多數(shù)蛋白質(zhì)中出現(xiàn)這種寡肽序列的概率極少，因此這種方法可廣泛用于從融合蛋白中回收各種不同大小的目的蛋白產(chǎn)物 融合型異源蛋白的表達(dá) 目的蛋白的回收 酶促裂解法： 多殘基位點(diǎn) 啟動(dòng)子 受體基因 接頭 目的基因 Met Arg Stop Lys Glu IleGluglyArg Arg Lys Glu IleGluglyArg 表達(dá) 親和層析 酶解回收 融合型異源蛋白的表達(dá) 目的蛋白的回收 酶促裂解法： 多殘基位點(diǎn) Pinpoin