【正文】 因上的密碼子在大腸桿菌細(xì)胞中獲得最佳表達(dá)： 外源基因全合成 同步表達(dá)相關(guān) tRNA編碼基因 密碼子 密碼子偏愛(ài)性對(duì)外源基因表達(dá)的影響 按照大腸桿菌密碼子的偏愛(ài)性規(guī)律，設(shè)計(jì)更換外源基因中不適宜的相應(yīng)簡(jiǎn)并密碼子，重組人胰島素、干擾素以及生長(zhǎng)激素在大腸桿菌中的高效表達(dá)均采用了這種方法 外源基因全合成 密碼子 密碼子偏愛(ài)性對(duì)外源基因表達(dá)的影響 對(duì)于那些含有不和諧密碼子種類單一、出現(xiàn)頻率較高、而本身分子量又較大的外源基因而言，則選擇相關(guān) tRNA編碼基因同步克隆表達(dá)的策略較為有利。為了提高人尿激酶原 cDNA在大腸桿菌中的高效表達(dá)，將大腸桿菌的這兩個(gè) tRNA編碼基因克隆在另一個(gè)高表達(dá)的質(zhì)粒上。質(zhì)粒分子的過(guò)度增殖以及其后目的基因的高效表達(dá)勢(shì)必會(huì)影響受體細(xì)胞的生長(zhǎng)代謝，進(jìn)而導(dǎo)致重組質(zhì)粒的不穩(wěn)定性以及目的基因宏觀表達(dá)水平的下降 解決上述難題的一種有效策略是將重組質(zhì)粒的擴(kuò)增納入可控制的軌道 質(zhì)?？截悢?shù) 質(zhì)粒擴(kuò)增時(shí)序的控制 pCP3擁有一個(gè)溫度可誘導(dǎo)型的復(fù)制子 pCP3 PL MCS ori Apr 在 28℃ 時(shí)，每個(gè)細(xì)胞的質(zhì)?？截悢?shù)為 60 在 42℃ 時(shí)，拷貝數(shù)迅速增至 300 600 在此溫度下，受體細(xì)胞染色體上的 CI基 因表達(dá)的溫度敏感型阻遏蛋白失活 因此，用一種手段同時(shí)控制質(zhì)粒拷 貝數(shù)和基因的表達(dá) C 大腸桿菌基因工程菌的構(gòu)建策略 6 大腸桿菌基因工程 包涵體型異源蛋白的表達(dá) 分泌型異源蛋白的表達(dá) 融合型異源蛋白的表達(dá) 寡聚型異源蛋白的表達(dá) 整合型異源蛋白的表達(dá) 蛋白酶抗性或缺陷型表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建 包涵體型異源蛋白的表達(dá) 包涵體及其性質(zhì) 在某些生長(zhǎng)條件下，大腸桿菌能積累某種特殊的生物大分子，它們致密地集聚在細(xì)胞內(nèi)，或被膜包裹或形成無(wú)膜裸露結(jié)構(gòu)，這種水不溶性的結(jié)構(gòu)稱為 包涵體 （ Inclusion Bodies， IB）。由高效表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建的大腸桿菌工程菌大量合成非天然性的同源或異源蛋白質(zhì)，后者在一般情況下也以包涵體的形式存在于細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)。然而，這也是一個(gè)技術(shù)難題，尤其當(dāng)目標(biāo)蛋白分子中的 Cys殘基數(shù)目較高時(shí)，體外復(fù)性蛋白質(zhì)的成功率相當(dāng)?shù)?，一般不超過(guò) 30% 包涵體型異源蛋白的表達(dá) 以包涵體形式表達(dá)目的蛋白的操作 如果未進(jìn)行特殊設(shè)計(jì)（如分泌型表達(dá)或融合型表達(dá)），外源基因在大腸桿菌中表達(dá)的蛋白量占細(xì)胞總蛋白量 20%以上時(shí)，表達(dá)產(chǎn)物一般傾向于形成包涵體。事實(shí)上，這種高表達(dá)率也是包涵體法的長(zhǎng)處所在 包涵體型異源蛋白的表達(dá) 包涵體的變性與復(fù)性操作 C 共價(jià)修飾的蛋白質(zhì) 蛋白質(zhì)變性復(fù)性的動(dòng)力學(xué)原理： C1 C2 Cn C U I 1 I n N X1 X2 Xn X Ag Ag Ag Ag I 有效變復(fù)性過(guò)程中的中間狀態(tài) X 脫離有效變復(fù)性過(guò)程而進(jìn)入集聚的中間狀態(tài) N 天然狀態(tài)的蛋白質(zhì) U 變性狀態(tài)的蛋白質(zhì) A 集聚狀態(tài)的蛋白質(zhì) 在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)， 集聚狀態(tài) 和 共價(jià)修飾 的蛋白質(zhì)不能進(jìn)入復(fù)性過(guò)程，因此永遠(yuǎn)成為 無(wú)活性的蛋白質(zhì)。能有效促進(jìn) 包涵體溶解變性的試劑和條件包括： 清洗劑 SDS、 正十二醇肌氨酸，廉價(jià)，但影響復(fù)性和純化 促溶劑 鹽酸胍 、尿素，前者昂貴，尿素便宜，但常被自發(fā) 形成的氰酸鹽污染，后者能與多肽鏈中的氨基反應(yīng) 混合溶劑 如 尿素與醋酸、二甲基砜等聯(lián)合使用，溶解力增強(qiáng) 極端 pH 廉價(jià)，但許多蛋白質(zhì)在極端 pH條件下發(fā)生修飾反應(yīng) 包涵體型異源蛋白的表達(dá) 包涵體的變性與復(fù)性操作 包涵體的復(fù)性與重折疊（ refolding）： 包涵體的復(fù)性與重折疊的主要任務(wù)是： 通過(guò) 次級(jí)鍵 的形成使蛋白質(zhì)復(fù)性 將多肽鏈中被拆開(kāi)的 游離巰基 重新折疊 包涵體型異源蛋白的表達(dá) 包涵體的變性與復(fù)性操作 包涵體的復(fù)性與重折疊（ refolding）： 復(fù)性操作 包涵體復(fù)性操作的方法包括： 分段稀釋法， 逐步降低變性劑的濃度，防止二次集聚的發(fā)生 一步稀釋法， 蛋白復(fù)性與濃度無(wú)關(guān)，但集聚與濃度關(guān)系很大 試劑添加法， 精氨酸、甘氨酸、甘油、蔗糖、 PEG、 Ca2+ 蛋白修飾法， 氨基檸檬酸酐酰化，蛋白帶負(fù)電，抑制集聚 產(chǎn)物隔離法， 將變性的蛋白分子固定化，避免其相互碰撞 分子伴侶法， GroEL、 GroES、 DnaK， 固定化，共表達(dá) 包涵體型異源蛋白的表達(dá) 包涵體的變性與復(fù)性操作 包涵體的復(fù)性與重折疊（ refolding）： 二硫鍵形成 在包涵體變性體系中，始終存在著還原劑，使多肽鏈中的巰基保持還原狀態(tài)，防 化學(xué)氧化法（ A） 需要電子受體，最廉價(jià)的電子受體為空氣，二硫鍵形成是 二硫鍵交換（ B） 需要還原型和氧化型谷胱甘肽（ GSH和 GSSG）， 二硫鍵 止二硫鍵錯(cuò)配導(dǎo)致嚴(yán)重的集聚。形成二硫鍵的方式主要有： 隨機(jī)的，僅適用于那些不含游離半胱氨酸殘基的蛋白質(zhì)的重折疊 形成相對(duì)特異，因此適用性較廣，重折疊效果好 HS HS S S + 2e + 2H+ A HS HS SSR HS + B RSSR S S 2RSH 分泌型異源蛋白的表達(dá) 在大腸桿菌中表達(dá)的異源蛋白按其在細(xì)胞中的定位可分為兩種形式：即以可溶性或不溶性（包涵體）狀態(tài)存在于細(xì)胞質(zhì)中；或者通過(guò)運(yùn)輸或分泌方式定位于細(xì)胞周質(zhì)，甚至穿過(guò)外膜進(jìn)入培養(yǎng)基中。當(dāng)這些真核基因在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)，蛋白質(zhì) N端的甲硫氨酸殘基往往不能被切除。外源真核生物基因很難在大腸桿菌中進(jìn)行分泌型表達(dá)，少數(shù)外源基因既便能分泌表達(dá)，但其表達(dá)率通常要比包涵體方式低很多，因此目前用于產(chǎn)業(yè)化的異源蛋白分泌型重組大腸桿菌盡管有，但并不普遍 分泌型異源蛋白的表達(dá) 蛋白質(zhì)的分泌機(jī)制 原核細(xì)菌周質(zhì)中含有多種 分子伴侶 可阻止分泌蛋白的隨機(jī)折疊 ， 分泌在細(xì)胞周質(zhì)或培養(yǎng)基中的重組蛋白很少形成分子間的二硫鍵交聯(lián)，因此與包涵體相比，分泌型重組蛋白具有較高比例的正確構(gòu)象，生物活性的回收率增加，且對(duì)蛋白酶不敏感 分泌型異源蛋白的表達(dá) 分泌型目的蛋白表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建 包括大腸桿菌在內(nèi)的絕大多數(shù)革蘭氏陰性菌不能將蛋白質(zhì)直接分 泌到胞外，但有些革蘭氏陰性菌能將細(xì)菌的抗菌蛋白（細(xì)菌素）分泌 到培養(yǎng)基中，這一過(guò)程嚴(yán)格依賴于細(xì)菌素釋放蛋白，它激活定位于內(nèi) 上的磷酸酯酶 ，導(dǎo)致細(xì)菌內(nèi)外膜的通透性增大。此時(shí)，用另一種攜帶大腸桿菌信號(hào) 肽編碼序列和目的基因的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化上述完全分泌型受體細(xì)胞，并 使用相同性質(zhì)的啟動(dòng)子介導(dǎo)目的基因的轉(zhuǎn)錄，則可實(shí)現(xiàn)目的蛋白從重 組大腸桿菌中的完全分泌。由這種雜合基因表達(dá)出的蛋白質(zhì)稱為 融合蛋白 。通過(guò)在 DNA水平上人工設(shè)計(jì)引入的蛋白酶切割位點(diǎn)或化學(xué)試劑特異性斷裂位點(diǎn)，可以在體外從純化的融合蛋白分子中釋放回收異源蛋白 融合型異源蛋白的表達(dá) 以融合形式表達(dá)目的蛋白的優(yōu)缺點(diǎn) 目的蛋白穩(wěn)定性高 尤其對(duì)分子量較小的多肽效果更佳 目的蛋白易于分離 利用受體蛋白成熟的抗體、配體、底物進(jìn) 目的蛋白表達(dá)率高 與受體蛋白共用一套完善的表達(dá)元件 胞內(nèi)形成良好的空間構(gòu)象，且大多具有水溶性 目的蛋白。在某些情況下，并不需要完整的受體結(jié)構(gòu)基因，目 的是盡可能避免融合蛋白分子中兩種組份的分子量過(guò)于接近， 融合蛋白的裂解工藝 兩個(gè)蛋白編碼序列應(yīng)保持一致的翻譯閱讀框架 融合型異源蛋白的表達(dá) 融合型目的蛋白表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建 用于融合蛋白構(gòu)建的受體蛋白： 谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（ GST） 維持良好空間構(gòu)象 硫氧化還原蛋白（ TrxA） 維持良好空間構(gòu)象 pTrxFus 麥芽糖結(jié)合蛋白（ MBP） 促進(jìn)分泌 金黃色葡萄球菌蛋白 A（ SAPA） 免疫親和層析 pRIT2T 外膜蛋白（ OmpF） 促進(jìn)分泌 b半乳糖苷酶（ LacZ） 免疫親和層析 泛素蛋白（ Ubi） 維持良好空間構(gòu)象 融合型異源蛋白的表達(dá) 目的蛋白的回收 融合蛋白中受體蛋白部分的存在可能會(huì)影響目的蛋白的空間構(gòu)象和生物活性，如果將之注入人體還會(huì)導(dǎo)致免疫反應(yīng)，因此在制備和生產(chǎn)藥用目的蛋白時(shí)，將融合蛋白中的受體蛋白部分完整除去是必不可少的工序。這一方法的優(yōu)點(diǎn)是回收率高（可達(dá)到 85%以上），專一性強(qiáng)，而且所產(chǎn)生的目的蛋白的 N端不含甲硫氨酸，與真核生物細(xì)胞中的成熟表達(dá)產(chǎn)物較為接近。幾種斷裂位點(diǎn)專一性最強(qiáng)的商品化蛋白 酶分別在多肽鏈中的 精氨酸 、 谷氨酸、賴氨 酸 殘基處切開(kāi)酰胺鍵，形成不含上述殘基的 下游斷裂肽段，與溴化氰化學(xué)斷裂法相似。純化后的融合