【正文】 、 降血糖作用 、 血漿藥代 動力學 等指標上均與天然胰島素沒有任何區(qū)別，而且還具有 無免疫 原性 、 注射吸收迅速等 優(yōu)點，充分展示了基因工程在生物醫(yī)藥領域 中的巨大潛力。雖然這條工藝路線并不比 AB鏈分別表達法更為簡捷， 而且還要使用兩種高純度的酶制劑，但理想的折疊率在很大程度上 彌補了工藝繁瑣的缺陷，使得每克最終產(chǎn)品的成本僅 50美元 。由此獲得的工程菌同時具備了穩(wěn)定高效表達可分泌型融合蛋白的優(yōu)良特性，為胰島素的后續(xù)分離純化工序減輕了負擔。 重組人胰島素的大腸桿菌工程菌的構建 A鏈和 B鏈同時表達法 tac bGal ori Apr Met Met M M N C B peptide A peptide 化學合成 AB鏈編碼序列 重組人胰島素 轉(zhuǎn)化 分離純化 CNBr 處理 特異性裂解 體外折疊 重組人胰島素的大腸桿菌工程菌的構建 分泌型重組人胰島素表達法 上述三種重組大腸桿菌的構建路線均采用胰島素或胰島素原編碼序列與大腸桿菌 b半乳糖苷酶 基因拼接的方法，所產(chǎn)生的融合型重組蛋白表達率高、穩(wěn)定性強，但不能分泌，只要以包涵體的形式存在于胞質(zhì)中。 為了進一步降低生產(chǎn)成本，美國 Ely LiLi公司隨后又建立了第 二條生產(chǎn)重組人胰島素的工藝路線。 人胰島素的生產(chǎn)方法 基因工程法制人胰島素 1982年，美國 Ely LiLi公司首先使用重組大腸桿菌生產(chǎn)人胰島 素，成為世界上第一個上市的基因工程藥物。這 條化學全合成的路線從技術上來說是能夠做到的，但其生產(chǎn) 成本奇高，從而也限制了產(chǎn)品的廣泛應用。 相反， N末端含有 Pro、 Glu、 Ser、 Thr的真核生物蛋白質(zhì)，在真核和原核細胞中的半衰期通常很短 ， 尤其 ProGluSerThr序列 （ PEST序列 ），是胞內(nèi)蛋白酶的超敏感區(qū)。熱休克基因 dnaK、 dnaJ、 groEL、 grpE以及環(huán)境壓力特異性 s因子編碼基因 htpR的突變株均呈現(xiàn)出對異源蛋白降解作用的嚴重缺陷，特別是 lonhtpR的雙缺陷株，非常適合高效表達各種不穩(wěn)定的重組異源蛋白 。 蛋白酶抗性或缺陷型表達系統(tǒng)的構建 實驗結果表明，大多數(shù)不穩(wěn)定的重組目的蛋白是被大腸桿菌中的蛋白酶 La和 Ti降解的，兩者分別由 lon和 clp基因編碼，其蛋白水解活性依賴于 ATP。 一般地說 ， 距離越遠 、 長度越長 、 同源性越高 ， 重組的頻率也就越高 ， 反之亦然 。隨著重組質(zhì)?？截悢?shù)的不斷增加，受體細胞內(nèi)的大部分能量和原料被用于合成所有的重組質(zhì)粒編碼蛋白，而細胞的正常生長代謝卻因能量不濟受到影響，因此通過增加質(zhì)?？截悢?shù)提高外源基因表達產(chǎn)物的產(chǎn)量往往不能獲得滿意的效果。 用上述蛋白酶裂解融合蛋白的前提條件是外 源蛋白分子內(nèi)部不能含有精氨酸、谷氨酸或 賴氨酸殘基，如果外源基因表達產(chǎn)物為小分子多肽，這一限制條件并不苛刻，但 大分子量的異源蛋白來說，上述三種氨基酸殘基的出現(xiàn)頻率是相當高的 Arg C N N C 受體蛋白 目的蛋白 融合型異源蛋白的表達 目的蛋白的回收 酶促裂解法： 多殘基位點 為了克服僅切單一氨基酸殘基的蛋白酶所帶來的應用局限性，可在受體蛋白編碼序列與不含起始密碼子的外源基因之間加裝一段編碼 寡肽序列 （ IleGluGlyArg） 的人工接頭片段，該寡肽為具有蛋白酶活性的 凝血因子 Xa的識別和作用序列，其斷裂位點在 Arg的C末端 。融合蛋白的位點專一性斷裂方法有兩種： 化學斷裂法 酶促裂解法 融合型異源蛋白的表達 目的蛋白的回收 用于蛋白位點專一性化學斷裂的最佳試劑為 溴化氰 （ CNBr）它與多肽鏈中的 甲硫氨酸 殘基側鏈的 硫醚基 反應，生成溴化亞氨內(nèi)酯，后者不穩(wěn)定，在水的作用下肽鍵斷裂，形成兩個多肽降解片段其中 上游肽段 的甲硫氨酸殘基轉(zhuǎn)化為 高絲氨酸 殘基，而下游肽段 N端的第一位氨基酸殘基保持不變。在這種融合蛋白結構中，通常受體細菌的蛋白部分位于 N端，異源蛋白位于 C端。 因此，只要將細菌素釋放蛋白編碼基因克隆在一個合適的質(zhì)粒上 即可構建完全分泌型的受體細胞。蛋白產(chǎn)物 N端 信號肽 序列的存在是蛋白質(zhì)分泌的前提條件 分泌型異源蛋白的表達 以分泌形式表達目的蛋白的優(yōu)缺點 分泌表達形式的優(yōu)點： 目的蛋白穩(wěn)定性高 重組人胰島素原若分泌到細胞周中，其穩(wěn) 穩(wěn)定性大約是在細胞質(zhì)中的 10倍 目的蛋白易于分離 目的蛋白末端完整 相當多的真核生物成熟蛋白 N端并不含有 甲硫氨酸殘基。包涵體中的蛋白質(zhì)就屬于這兩種狀態(tài)，因此需要在體外進行人 工變性（解除共價修飾和驅(qū)散集聚體）復性操作 包涵體型異源蛋白的表達 包涵體的變性與復性操作 包涵體的溶解與變性： 包涵體的溶解與變性的主要任務是拆開錯配的 二硫鍵 和 次級鍵 在人工條件下，使包涵體溶解并重新進入復性途徑中。除此之外，包涵體中還含有少量的 DNA、 RNA和脂多糖等非蛋白分子 包涵體型異源蛋白的表達 以包涵體形式表達目的蛋白的優(yōu)缺點 能簡化外源基因表達產(chǎn)物的分離操作 包涵體表達形式的優(yōu)點： 包涵體的水難溶性及其密度遠大于其它細胞碎片和細胞成分，菌體經(jīng)超聲波裂解后，直接通過高速離心即可將重組異源蛋白從細菌裂解物中分離出來 能在一定程度上保持表達產(chǎn)物的結構穩(wěn)定 在形成包涵體之后，大腸桿菌的蛋白酶降解作用基本上對異源重組蛋白的穩(wěn)定性已構不成威脅 包涵體型異源蛋白的表達 以包涵體形式表達目的蛋白的優(yōu)缺點 包涵體表達形式的缺點： 以包涵體形式表達的重組蛋白喪失了原有的生物活性，必須通過有效的變性復性操作，才能回收得到具有正確空間構象（因而具有生物活性）的目標蛋白，因此包涵體變復性操作的效率對目標產(chǎn)物的收率至關重要。由此構建的大腸桿菌雙質(zhì)粒系統(tǒng)有效地解除了受體細胞對外源基因高效表達的制約作用 同步表達相關 tRNA編碼基因 質(zhì)?？截悢?shù) 質(zhì)粒拷貝數(shù)對細菌生長代謝的影響 目前實驗室里廣泛使用的表達型質(zhì)粒在每個大腸桿菌細胞中可達數(shù)百甚至上千個拷貝，質(zhì)粒的擴增過程通常發(fā)生在受體細胞的對數(shù)生長期內(nèi)，而此時正是細菌生理代謝最旺盛的階段。除此之外，從 AUG開始的前幾個密碼子堿基序列也至關重要，至少這一序列不能與 mRNA的 5’ 端非編碼區(qū)形成莖環(huán)結構，否則便會嚴重干擾 mRNA在核糖體上的準確定位 目前廣泛用于外源基因表達的大腸桿菌表達型質(zhì)粒上，均含有與啟動子來源相同的核糖體結合位點序列，序列和間隔是最佳的 密碼子 生物體對密碼子的偏愛性 不同的生物，甚至同種生物不同的蛋白質(zhì)編碼基因，對簡并密碼 子使用頻率并不相同，具有一定的偏愛性，其決定因素是： 生物基因組中的堿基含量 在富含 AT的生物（如單鏈 DNA噬菌體 fX174） 基因組中，密碼子第三位上的 U和 A出現(xiàn)的頻率較高；而在 GC 豐富的生物（如鏈霉菌）基因組中，第三位上含有 G或 C的簡并密碼子 占 90%以上的絕對優(yōu)勢 密碼子與反密碼子相互作用的自由能 性中等強度規(guī)律 細胞 內(nèi) tRNA的含量 如 GGG、 CCC、 GCG、 GGC、 AAA、 UUU、 AUA、 UAU等使用少； 如 GUG、 CAC、 UCG、 AGC、 ACA、 UGU、 AUC、 UUG等使用多； 密碼子 密碼子偏愛性對外源基因表達的影響 由于原核生物和真核生物基因組中密碼子的使用頻率具有較大程 大的差異性，因此外源基因尤其是高等哺乳動物基因在大腸桿菌中高 效翻譯的一個重要因素是密碼子的正確選擇。 mRNA翻譯的起始效率主要由其 5‘ 端的結構序列所決定，稱為 核糖體結合位點 （ RBS） 核糖體結合位點 大腸桿菌核糖體結合位點包括下列四個特征結構要素： 位于翻譯起始密碼子上游的 68個核苷酸序列 5’ UAAGGAGG 3’，即 ShineDalgarno（ SD） 序列 ， 它通過識別大腸桿菌核糖體小亞基中的 16S rRNA 3’端區(qū)域 3’ AUUCCUCC 5’并與之專一性結合 ， 將mRNA定位于核糖體上 ， 從而啟動翻譯； 翻譯起始密碼子 ， 大腸桿菌絕大部分基因以 AUG作為閱讀框架的起始位點 ， 但有些基因也使用 GUG或 UUG作為翻譯起始密碼子； SD序列與翻譯起始密碼子之間的距離及堿基組成 ； 基因編碼區(qū) 5’ 端若干密碼子的堿基序列 核糖體結合位點的結構 核糖體結合位點 核糖體結合位點對外源基因表達的影響 SD序列的影響 ： 一般來說， mRNA與核糖體的結合程度越強，翻譯的起始效率就越高，而這種結合程度主要取決于 SD序列