基因工程第五章載體-全文預(yù)覽
【正文】 的外源基因插入位點(diǎn)在兩個(gè)抗性基因中 ? 質(zhì)粒的序列含有必要區(qū)和非必要區(qū)。 ? 質(zhì)粒的大小：通常質(zhì)粒越大，拷貝數(shù)也越少，所以我們?cè)谶M(jìn)行基因重組時(shí)，首先要選擇分子量小的質(zhì)粒，其次質(zhì)粒分子量大的要使外源基因的片斷長度合適，不要過大。 ： ? 寄主自身的遺傳背景： ? 質(zhì)粒一般都保藏在質(zhì)粒中，所以質(zhì)粒的穩(wěn)定性直接與寄主的特性有關(guān)，我們?cè)诨蚬こ讨胁捎玫募闹骷?xì)胞都是經(jīng)過人為改造過得微生物，如 JM110，JM10 XL1Blue等，這些菌株的 end基因均發(fā)生了突變， end基因負(fù)責(zé)編碼核酸內(nèi)切酶 I，突變后，菌株就失去了編碼能力，從而保證了質(zhì)粒在宿主細(xì)胞中穩(wěn)定存在。用 2倍體積的無水乙醇沉淀雙鏈DNA。蓋緊管口， 溫和 地振蕩 10秒鐘使溶液 Ⅲ 在粘稠的細(xì)菌裂解物中分散均勻，之后將管置于冰上 3— 5分鐘。 SDS破壞原生質(zhì)體，然后 DNA變性。CI (pH 8． 0)， 10mmol／ L EDTA(pH 8． 0，溶菌酶 4－ 5mg，酶作用環(huán)境由緩沖液提供 )。 ?第一步：（ 1）在 5m1含相應(yīng)抗生素的 LB培養(yǎng)基中接種一單菌落，于 37℃ 劇烈振蕩培養(yǎng)過夜。 嚴(yán)緊型：質(zhì)粒的復(fù)制的啟動(dòng)，受寄主細(xì)胞的復(fù)制起始蛋白的調(diào)控，復(fù)制起始蛋白是細(xì)胞在進(jìn)行 DNA復(fù)制時(shí)產(chǎn)生的，所以嚴(yán)緊型質(zhì)粒的復(fù)制是宿主細(xì)胞進(jìn)行染色體復(fù)制時(shí)才能進(jìn)行復(fù)制的質(zhì)粒，依賴于宿主細(xì)胞，自身不能合成復(fù)制起始蛋白。這種質(zhì)粒的拷貝數(shù)低。 ? 線性結(jié)構(gòu)：質(zhì)粒在限制性酶作用下，雙鏈斷裂，形成線性，又叫 L型。如熒光假單孢菌。 1959－ 1960年日本人發(fā)現(xiàn)了抗藥性因子。 如 :大腸桿菌中的 F質(zhì)粒、 R質(zhì)粒、 COL質(zhì)粒。 適當(dāng)?shù)目截悢?shù)。Chapter five vectors Agriculture university of Hebei Province ? 載體的概念：載體是基因工程中攜帶目的基因進(jìn)入宿主細(xì)胞，可自我或隨同宿主 DNA的復(fù)制而復(fù)制，及表達(dá)的工具。如抗藥性、顯色表型、營養(yǎng)缺陷型、熒光表型等 . 有一個(gè)或幾個(gè)限制性酶切酶的單一識(shí)別位點(diǎn)，便于外源基因的插入。質(zhì)粒常含有一些編碼對(duì)細(xì)菌生存有利的基因，比如說抗性基因，降解復(fù)雜有機(jī)物的酶、細(xì)菌素，并且可賦予微生物特殊的外形 ――― 鞭毛、菌毛、芽孢等。這樣一旦微生物具有了抗性質(zhì)粒，就出現(xiàn)對(duì)抗生素的抗性。 如何識(shí)別微生物是不是含有質(zhì)粒 ？ ?首先要看微生物的形態(tài)（同種微生物形態(tài)不同，可能含有），其次要從細(xì)胞中提取質(zhì)粒。 質(zhì)粒分子三種存在形式：（主要與復(fù)制有關(guān)） ? 共價(jià)閉合超螺旋形式：（ covalently closed circular，簡寫cccDNA） ? 開放環(huán)結(jié)構(gòu)：一條保持著完整的環(huán)結(jié)構(gòu)，另一條有一個(gè)或數(shù)個(gè)切刻。 3. 質(zhì)粒 DNA的分子量和拷貝數(shù)： 按質(zhì)粒的分子量大小，可分為量大類： 3――7kb ，拷貝數(shù)多； 70－ 150kb，含有與質(zhì)粒功能有關(guān)的更多基因，可自我傳遞（可編碼一套控制質(zhì)粒 DNA轉(zhuǎn)移的基因，所以可從一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)到另一個(gè)細(xì)胞），如果一個(gè)細(xì)胞含有這種質(zhì)粒，他可以帶動(dòng)小質(zhì)粒進(jìn)行傳遞轉(zhuǎn)移。 4. 質(zhì)粒 DNA的復(fù)制類型： 根據(jù)質(zhì)粒復(fù)制所受控制的方式和在寄主細(xì)胞所含質(zhì)?？截悢?shù)的多少： 松弛型：質(zhì)粒的復(fù)制可自由完成，自身可編碼與復(fù)制有關(guān)的功能蛋白，所以在細(xì)胞的生命周期中，可隨時(shí)進(jìn)行自我復(fù)制，所以松弛型的拷貝數(shù)
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