【正文】 與 16S rRNA的堿基互補(bǔ)性，其中以 GGAG四個(gè)堿基序列尤為重要。 cI857阻遏蛋 在 42℃ 時(shí)失活脫落， PL便可介導(dǎo) 目的基因的表達(dá)。因此， 基因工程中使用的乳糖啟動(dòng) 子均為抗葡萄糖代謝阻遏的 突變型，即 Plac UV5 CAP cAMP cAMP濃度降低 Plac UV5 O 高效轉(zhuǎn)錄 啟動(dòng)子 啟動(dòng)子的可控性 Ptrp 色氨酸啟動(dòng)子 Ptrp的可控性： Otrp 除去 色氨酸 色氨酸啟動(dòng)子 Ptrp受色氨酸 阻遏 蛋白復(fù)合物的阻遏，轉(zhuǎn)錄呈基底 狀態(tài)。葡萄糖 代謝使 cAMP減少，也能阻 遏 Plac介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄。在基因 工程中常使用溫度敏感型的 cI突 變基因 cI857控制 PL。大腸桿菌細(xì)胞中結(jié)構(gòu)不同的 mRNA分子具有不同的翻譯效率，它們之間的差別有時(shí)可高達(dá)數(shù)百倍。在很多情況下， SD序列位于 AUG之前大約 七個(gè)堿基 處，在此間隔中少一個(gè)堿基或多一個(gè)堿基，均會(huì)導(dǎo)致翻譯起始效率不同程度的降低 核糖體結(jié)合位點(diǎn) 核糖體結(jié)合位點(diǎn)對(duì)外源基因表達(dá)的影響 起始密碼子及其后續(xù)若干密碼子的影響 ： 大腸桿菌中的起始 tRNA分子可以同時(shí)識(shí)別 AUG、 GUG和 UUG三種起始密碼子，但其識(shí)別頻率并不相同，通常 GUG為 AUG的 50%而 UUG只及 AUG的 25%。為了提高人尿激酶原 cDNA在大腸桿菌中的高效表達(dá)，將大腸桿菌的這兩個(gè) tRNA編碼基因克隆在另一個(gè)高表達(dá)的質(zhì)粒上。由高效表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建的大腸桿菌工程菌大量合成非天然性的同源或異源蛋白質(zhì)，后者在一般情況下也以包涵體的形式存在于細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)。事實(shí)上，這種高表達(dá)率也是包涵體法的長(zhǎng)處所在 包涵體型異源蛋白的表達(dá) 包涵體的變性與復(fù)性操作 C 共價(jià)修飾的蛋白質(zhì) 蛋白質(zhì)變性復(fù)性的動(dòng)力學(xué)原理： C1 C2 Cn C U I 1 I n N X1 X2 Xn X Ag Ag Ag Ag I 有效變復(fù)性過程中的中間狀態(tài) X 脫離有效變復(fù)性過程而進(jìn)入集聚的中間狀態(tài) N 天然狀態(tài)的蛋白質(zhì) U 變性狀態(tài)的蛋白質(zhì) A 集聚狀態(tài)的蛋白質(zhì) 在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)， 集聚狀態(tài) 和 共價(jià)修飾 的蛋白質(zhì)不能進(jìn)入復(fù)性過程，因此永遠(yuǎn)成為 無活性的蛋白質(zhì)。形成二硫鍵的方式主要有： 隨機(jī)的，僅適用于那些不含游離半胱氨酸殘基的蛋白質(zhì)的重折疊 形成相對(duì)特異，因此適用性較廣，重折疊效果好 HS HS S S + 2e + 2H+ A HS HS SSR HS + B RSSR S S 2RSH 分泌型異源蛋白的表達(dá) 在大腸桿菌中表達(dá)的異源蛋白按其在細(xì)胞中的定位可分為兩種形式：即以可溶性或不溶性（包涵體）狀態(tài)存在于細(xì)胞質(zhì)中；或者通過運(yùn)輸或分泌方式定位于細(xì)胞周質(zhì)，甚至穿過外膜進(jìn)入培養(yǎng)基中。外源真核生物基因很難在大腸桿菌中進(jìn)行分泌型表達(dá)，少數(shù)外源基因既便能分泌表達(dá)，但其表達(dá)率通常要比包涵體方式低很多，因此目前用于產(chǎn)業(yè)化的異源蛋白分泌型重組大腸桿菌盡管有，但并不普遍 分泌型異源蛋白的表達(dá) 蛋白質(zhì)的分泌機(jī)制 原核細(xì)菌周質(zhì)中含有多種 分子伴侶 可阻止分泌蛋白的隨機(jī)折疊 ， 分泌在細(xì)胞周質(zhì)或培養(yǎng)基中的重組蛋白很少形成分子間的二硫鍵交聯(lián)，因此與包涵體相比，分泌型重組蛋白具有較高比例的正確構(gòu)象，生物活性的回收率增加，且對(duì)蛋白酶不敏感 分泌型異源蛋白的表達(dá) 分泌型目的蛋白表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建 包括大腸桿菌在內(nèi)的絕大多數(shù)革蘭氏陰性菌不能將蛋白質(zhì)直接分 泌到胞外，但有些革蘭氏陰性菌能將細(xì)菌的抗菌蛋白（細(xì)菌素）分泌 到培養(yǎng)基中，這一過程嚴(yán)格依賴于細(xì)菌素釋放蛋白，它激活定位于內(nèi) 上的磷酸酯酶 ，導(dǎo)致細(xì)菌內(nèi)外膜的通透性增大。由這種雜合基因表達(dá)出的蛋白質(zhì)稱為 融合蛋白 。在某些情況下，并不需要完整的受體結(jié)構(gòu)基因，目 的是盡可能避免融合蛋白分子中兩種組份的分子量過于接近， 融合蛋白的裂解工藝 兩個(gè)蛋白編碼序列應(yīng)保持一致的翻譯閱讀框架 融合型異源蛋白的表達(dá) 融合型目的蛋白表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建 用于融合蛋白構(gòu)建的受體蛋白： 谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（ GST） 維持良好空間構(gòu)象 硫氧化還原蛋白（ TrxA） 維持良好空間構(gòu)象 pTrxFus 麥芽糖結(jié)合蛋白（ MBP） 促進(jìn)分泌 金黃色葡萄球菌蛋白 A（ SAPA） 免疫親和層析 pRIT2T 外膜蛋白（ OmpF） 促進(jìn)分泌 b半乳糖苷酶（ LacZ） 免疫親和層析 泛素蛋白（ Ubi） 維持良好空間構(gòu)象 融合型異源蛋白的表達(dá) 目的蛋白的回收 融合蛋白中受體蛋白部分的存在可能會(huì)影響目的蛋白的空間構(gòu)象和生物活性，如果將之注入人體還會(huì)導(dǎo)致免疫反應(yīng)，因此在制備和生產(chǎn)藥用目的蛋白時(shí)，將融合蛋白中的受體蛋白部分完整除去是必不可少的工序。幾種斷裂位點(diǎn)專一性最強(qiáng)的商品化蛋白 酶分別在多肽鏈中的 精氨酸 、 谷氨酸、賴氨 酸 殘基處切開酰胺鍵，形成不含上述殘基的 下游斷裂肽段，與溴化氰化學(xué)斷裂法相似。然而重組質(zhì)粒除了含有外源基因外，還攜帶其它的可轉(zhuǎn)錄基因，如作為篩選標(biāo)記的抗生素抗性基因等。細(xì)胞內(nèi)的 遺傳重組 可分為兩大類： 轉(zhuǎn)位因子依賴型 同源序列依賴型 整合型異源蛋白的表達(dá) DNA體內(nèi)重組的基本原理 轉(zhuǎn)位因子 是指生物細(xì)胞內(nèi)天然存在的一類無復(fù)制能力的 DNA可移動(dòng)因子，不同生物種群擁有結(jié)構(gòu)不同的轉(zhuǎn)位因子，例如： 轉(zhuǎn)位因子依賴型的體內(nèi)重組： 轉(zhuǎn)位因子家族 噬菌體 G片段（ GFragment） 原核細(xì)菌 插入順序（ IS） 真核細(xì)菌 轉(zhuǎn)座子（ Tn、 Ty） 高等植物 可移動(dòng)因子（ Ac、 Ds） 高等動(dòng)物 跳躍基因（ mobil gene） 整合型異源蛋白的表達(dá) DNA體內(nèi)重組的基本原理 轉(zhuǎn)位因子依賴型的體內(nèi)重組： 轉(zhuǎn)位因子的結(jié)構(gòu) IS（ 1 kb） Ty（ 5 kb） Tn（ 2 20 kb） ACCATGGTT TTGGTACCA 抗藥性基因 轉(zhuǎn)位酶基因 識(shí)別位點(diǎn) 阻遏基因 IR IR IR IR IS IS 整合型異源蛋白的表達(dá) DNA體內(nèi)重組的基本原理 轉(zhuǎn)位因子依賴型的體內(nèi)重組： 整合形式 整合型異源蛋白的表達(dá) DNA體內(nèi)重組的基本原理 在很多原核細(xì)菌細(xì)胞中 ， 染色體 DNA鏈上的兩個(gè)同源區(qū)之間可發(fā)生所謂的同源重組 ， 其頻率與細(xì)菌種類 、 兩個(gè)同源區(qū)之間的距離同源區(qū)的長(zhǎng)度 、 同源程度密切相關(guān) 。然而越來越多的實(shí)驗(yàn)表明，重組目的蛋白在受體細(xì)胞內(nèi)的半衰期可以通過蛋白序列的人工設(shè)計(jì)以及受體細(xì)胞的改造加以調(diào)整和控制。 蛋白酶缺陷型受體細(xì)胞的改造 lon基因缺陷的大腸桿菌受體（ lon ）： 蛋白酶抗性或缺陷型表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建 大腸桿菌中龐大的熱休克蛋白家族對(duì)異?；?異源蛋白的降解也有重要作用，其機(jī)理是脅迫 異?；?異源蛋白形成一種對(duì)蛋白 酶識(shí)別和降解較有利的空間構(gòu)象，從而提高 異常或 異源蛋白對(duì)蛋白酶的敏感性。 抗蛋白酶的重組異源蛋白序列的設(shè)計(jì) 多肽鏈 C末端氨基酸序列對(duì)穩(wěn)定性的影響： 蛋白酶抗性或缺陷型表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建 大量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果同時(shí)表明，如果多肽鏈的 N末端序列中含有較高比例的 Ala、 Asn、 Cys、 Gln、 His， 則蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性顯著改善。 人胰島素的生產(chǎn)方法 化學(xué)合成法制人胰島素 根據(jù)人胰島素 A鏈和 B鏈的序列，由單個(gè)氨基酸從頭合成。該過程的總轉(zhuǎn)化率為 60% 但工藝路線耗時(shí)，分離純化操作復(fù)雜，產(chǎn)品的價(jià)格不菲。 重組人胰島素的大腸桿菌工程菌的構(gòu)建 A鏈和 B鏈分別表達(dá)法 基因工程菌的構(gòu)建戰(zhàn)略： tac tac bGal bGal A peptide B peptide ori ori Apr Apr Met Met Met Met M M N C M M N C 化學(xué)合成 A鏈 和 B鏈的編碼 序列 重組人胰島素的大腸桿菌工程菌的構(gòu)建 A鏈和 B鏈分別表達(dá)法 表達(dá)產(chǎn)物的后處理路線： M M N C M M N C bGal bGal A B CNBr 處理 N C S S S S C N S S N C N C N C N C Cys 體外氧化和重折疊 分離純化 重組人胰島素的大腸桿菌工程菌的構(gòu)建 A鏈和 B鏈分別表達(dá)法 生產(chǎn)技術(shù)的評(píng)價(jià)： 由于 A鏈和 B鏈上共存在六個(gè)半胱氨酸殘基，體外二硫鍵的正 確配對(duì)率較低，通常只有 10% 20%，因此采用這條工藝路線生 產(chǎn)的重組人胰島素每克成本高達(dá) 100美元 以上。 目前美國 Ely LiLi公司采用此工藝年產(chǎn) 十幾噸 的重組人胰島素。