【正文】 上述三種重組大腸桿菌的構(gòu)建路線均采用胰島素或胰島素原編碼序列與大腸桿菌 b半乳糖苷酶 基因拼接的方法，所產(chǎn)生的融合型重組蛋白表達率高、穩(wěn)定性強，但不能分泌，只要以包涵體的形式存在于胞質(zhì)中。 人胰島素的生產(chǎn)方法 基因工程法制人胰島素 1982年，美國 Ely LiLi公司首先使用重組大腸桿菌生產(chǎn)人胰島 素，成為世界上第一個上市的基因工程藥物。 相反， N末端含有 Pro、 Glu、 Ser、 Thr的真核生物蛋白質(zhì)，在真核和原核細胞中的半衰期通常很短 ， 尤其 ProGluSerThr序列 （ PEST序列 ），是胞內(nèi)蛋白酶的超敏感區(qū)。 蛋白酶抗性或缺陷型表達系統(tǒng)的構(gòu)建 實驗結(jié)果表明，大多數(shù)不穩(wěn)定的重組目的蛋白是被大腸桿菌中的蛋白酶 La和 Ti降解的，兩者分別由 lon和 clp基因編碼，其蛋白水解活性依賴于 ATP。隨著重組質(zhì)?？截悢?shù)的不斷增加，受體細胞內(nèi)的大部分能量和原料被用于合成所有的重組質(zhì)粒編碼蛋白，而細胞的正常生長代謝卻因能量不濟受到影響，因此通過增加質(zhì)粒拷貝數(shù)提高外源基因表達產(chǎn)物的產(chǎn)量往往不能獲得滿意的效果。融合蛋白的位點專一性斷裂方法有兩種： 化學斷裂法 酶促裂解法 融合型異源蛋白的表達 目的蛋白的回收 用于蛋白位點專一性化學斷裂的最佳試劑為 溴化氰 （ CNBr）它與多肽鏈中的 甲硫氨酸 殘基側(cè)鏈的 硫醚基 反應(yīng)，生成溴化亞氨內(nèi)酯，后者不穩(wěn)定，在水的作用下肽鍵斷裂，形成兩個多肽降解片段其中 上游肽段 的甲硫氨酸殘基轉(zhuǎn)化為 高絲氨酸 殘基，而下游肽段 N端的第一位氨基酸殘基保持不變。 因此，只要將細菌素釋放蛋白編碼基因克隆在一個合適的質(zhì)粒上 即可構(gòu)建完全分泌型的受體細胞。包涵體中的蛋白質(zhì)就屬于這兩種狀態(tài)，因此需要在體外進行人 工變性（解除共價修飾和驅(qū)散集聚體）復(fù)性操作 包涵體型異源蛋白的表達 包涵體的變性與復(fù)性操作 包涵體的溶解與變性： 包涵體的溶解與變性的主要任務(wù)是拆開錯配的 二硫鍵 和 次級鍵 在人工條件下，使包涵體溶解并重新進入復(fù)性途徑中。由此構(gòu)建的大腸桿菌雙質(zhì)粒系統(tǒng)有效地解除了受體細胞對外源基因高效表達的制約作用 同步表達相關(guān) tRNA編碼基因 質(zhì)?？截悢?shù) 質(zhì)?？截悢?shù)對細菌生長代謝的影響 目前實驗室里廣泛使用的表達型質(zhì)粒在每個大腸桿菌細胞中可達數(shù)百甚至上千個拷貝，質(zhì)粒的擴增過程通常發(fā)生在受體細胞的對數(shù)生長期內(nèi)，而此時正是細菌生理代謝最旺盛的階段。 mRNA翻譯的起始效率主要由其 5‘ 端的結(jié)構(gòu)序列所決定，稱為 核糖體結(jié)合位點 （ RBS） 核糖體結(jié)合位點 大腸桿菌核糖體結(jié)合位點包括下列四個特征結(jié)構(gòu)要素： 位于翻譯起始密碼子上游的 68個核苷酸序列 5’ UAAGGAGG 3’，即 ShineDalgarno（ SD） 序列 ， 它通過識別大腸桿菌核糖體小亞基中的 16S rRNA 3’端區(qū)域 3’ AUUCCUCC 5’并與之專一性結(jié)合 ， 將mRNA定位于核糖體上 ， 從而啟動翻譯； 翻譯起始密碼子 ， 大腸桿菌絕大部分基因以 AUG作為閱讀框架的起始位點 ， 但有些基因也使用 GUG或 UUG作為翻譯起始密碼子； SD序列與翻譯起始密碼子之間的距離及堿基組成 ； 基因編碼區(qū) 5’ 端若干密碼子的堿基序列 核糖體結(jié)合位點的結(jié)構(gòu) 核糖體結(jié)合位點 核糖體結(jié)合位點對外源基因表達的影響 SD序列的影響 ： 一般來說， mRNA與核糖體的結(jié)合程度越強，翻譯的起始效率就越高，而這種結(jié)合程度主要取決于 SD序列與 16S rRNA的堿基互補性，其中以 GGAG四個堿基序列尤為重要。因此， 基因工程中使用的乳糖啟動 子均為抗葡萄糖代謝阻遏的 突變型，即 Plac UV5 CAP cAMP cAMP濃度降低 Plac UV5 O 高效轉(zhuǎn)錄 啟動子 啟動子的可控性 Ptrp 色氨酸啟動子 Ptrp的可控性： Otrp 除去 色氨酸 色氨酸啟動子 Ptrp受色氨酸 阻遏 蛋白復(fù)合物的阻遏，轉(zhuǎn)錄呈基底 狀態(tài)。在基因 工程中常使用溫度敏感型的 cI突 變基因 cI857控制 PL。在很多情況下， SD序列位于 AUG之前大約 七個堿基 處，在此間隔中少一個堿基或多一個堿基，均會導(dǎo)致翻譯起始效率不同程度的降低 核糖體結(jié)合位點 核糖體結(jié)合位點對外源基因表達的影響 起始密碼子及其后續(xù)若干密碼子的影響 ： 大腸桿菌中的起始 tRNA分子可以同時識別 AUG、 GUG和 UUG三種起始密碼子，但其識別頻率并不相同，通常 GUG為 AUG的 50%而 UUG只及 AUG的 25%。由高效表達質(zhì)粒構(gòu)建的大腸桿菌工程菌大量合成非天然性的同源或異源蛋白質(zhì)，后者在一般情況下也以包涵體的形式存在于細菌細胞內(nèi)。形成二硫鍵的方式主要有： 隨機的，僅適用于那些不含游離半胱氨酸殘基的蛋白質(zhì)的重折疊 形成相對特異，因此適用性較廣，重折疊效果好 HS HS S S + 2e + 2H+ A HS HS SSR HS + B RSSR S S 2RSH 分泌型異源蛋白的表達 在大腸桿菌中表達的異源蛋白按其在細胞中的定位可分為兩種形式：即以可溶性或不溶性（包涵體）狀態(tài)存在于細胞質(zhì)中；或者通過運輸或分泌方式定位于細胞周質(zhì)，甚至穿過外膜進入培養(yǎng)基中。由這種雜合基因表達出的蛋白質(zhì)稱為 融合蛋白 。幾種斷裂位點專一性最強的商品化蛋白 酶分別在多肽鏈中的 精氨酸 、 谷氨酸、賴氨 酸 殘基處切開酰胺鍵，形成不含上述殘基的 下游斷裂肽段，與溴化氰化學斷裂法相似。細胞內(nèi)的 遺傳重組 可分為兩大類： 轉(zhuǎn)位因子依賴型 同源序列依賴型 整合型異源蛋白的表達 DNA體內(nèi)重組的基本原理 轉(zhuǎn)位因子 是指生物細胞內(nèi)天然存在的一類無復(fù)制能力的 DNA可移動因子，不同生物種群擁有結(jié)構(gòu)不同的轉(zhuǎn)位因子，例如： 轉(zhuǎn)位因子依賴型的體內(nèi)重組： 轉(zhuǎn)位因子家族 噬菌體 G片段（ GFragment） 原核細菌 插入順序（ IS） 真核細菌 轉(zhuǎn)座子（ Tn、 Ty） 高等植物 可移動因子（ Ac、 Ds） 高等動物 跳躍基因（ mobil gene） 整合型異源蛋白的表達 DNA體內(nèi)重組的基本原理 轉(zhuǎn)位因子依賴型的體內(nèi)重組： 轉(zhuǎn)位因子的結(jié)構(gòu) IS（ 1 kb） Ty（ 5 kb） Tn（ 2 20 kb） ACCATGGTT TTGGTACCA 抗藥性基因 轉(zhuǎn)位酶基因 識別位點 阻遏基因 IR IR IR IR IS IS 整合型異源蛋白的表達 DNA體內(nèi)重組的基本原理 轉(zhuǎn)位因子依賴型的體內(nèi)重組： 整合形式 整合型異源蛋白的表達 DNA體內(nèi)重組的基本原理 在很多原核細菌細胞中 ， 染色體 DNA鏈上的兩個同源區(qū)之間可發(fā)生所謂的同源重組 ， 其頻率與細菌種類 、 兩個同源區(qū)之間的距離同源區(qū)的長度 、 同源程度密切相關(guān) 。 蛋白酶缺陷型受體細胞的改造 lon基因缺陷的大腸桿菌受體（ lon ）： 蛋白酶抗性或缺陷型表達系統(tǒng)的構(gòu)建 大腸桿菌中龐大的熱休克蛋白家族對異?；?異源蛋白的降解也有重要作用，其機理是脅迫 異常或 異源蛋白形成一種對蛋白 酶識別和降解較有利的空間構(gòu)象，從而提高 異?；?異源蛋白對蛋白酶的敏感性。 人胰島素的生產(chǎn)方法 化學合成法制人胰島素 根據(jù)人胰島素 A鏈和 B鏈的序列，由單個氨基酸從頭合成。 重組人胰島素的大腸桿菌工程菌的構(gòu)建 A鏈和 B鏈分別表達法 基因工程菌的構(gòu)建戰(zhàn)略： tac tac bGal bGal A peptide B peptide ori ori Apr Apr Met Met Met Met M M N C M M N C 化學合成 A鏈 和 B鏈的編碼 序列 重組人胰島素的大腸桿菌工程菌的構(gòu)建 A鏈和 B鏈分別表達法 表達產(chǎn)物的后處理路線： M M N C M M N C bGal bGal A B CNBr 處理 N C S S S S C N S S N C N C N C N C Cys 體外氧化和重折疊 分離純化 重組人胰島素的大腸桿菌工程菌的構(gòu)建 A鏈和 B鏈分別表達法 生產(chǎn)技術(shù)的評價： 由于 A鏈和 B鏈上共存在六個半胱氨酸殘基，體外二硫鍵的正 確配對率較低，通常只有 10% 20%，因此采用這條工藝路線生 產(chǎn)的重組人胰島素每克成本高達 100美元 以上。