【正文】 重組人胰島素的大腸桿菌工程菌的構(gòu)建 A鏈和 B鏈分別表達(dá)法 基因工程菌的構(gòu)建戰(zhàn)略： tac tac bGal bGal A peptide B peptide ori ori Apr Apr Met Met Met Met M M N C M M N C 化學(xué)合成 A鏈 和 B鏈的編碼 序列 重組人胰島素的大腸桿菌工程菌的構(gòu)建 A鏈和 B鏈分別表達(dá)法 表達(dá)產(chǎn)物的后處理路線： M M N C M M N C bGal bGal A B CNBr 處理 N C S S S S C N S S N C N C N C N C Cys 體外氧化和重折疊 分離純化 重組人胰島素的大腸桿菌工程菌的構(gòu)建 A鏈和 B鏈分別表達(dá)法 生產(chǎn)技術(shù)的評(píng)價(jià)： 由于 A鏈和 B鏈上共存在六個(gè)半胱氨酸殘基，體外二硫鍵的正 確配對(duì)率較低，通常只有 10% 20%，因此采用這條工藝路線生 產(chǎn)的重組人胰島素每克成本高達(dá) 100美元 以上。 蛋白酶缺陷型受體細(xì)胞的改造 lon基因缺陷的大腸桿菌受體（ lon ）： 蛋白酶抗性或缺陷型表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建 大腸桿菌中龐大的熱休克蛋白家族對(duì)異常或 異源蛋白的降解也有重要作用，其機(jī)理是脅迫 異?；?異源蛋白形成一種對(duì)蛋白 酶識(shí)別和降解較有利的空間構(gòu)象，從而提高 異?；?異源蛋白對(duì)蛋白酶的敏感性。幾種斷裂位點(diǎn)專一性最強(qiáng)的商品化蛋白 酶分別在多肽鏈中的 精氨酸 、 谷氨酸、賴氨 酸 殘基處切開(kāi)酰胺鍵，形成不含上述殘基的 下游斷裂肽段，與溴化氰化學(xué)斷裂法相似。形成二硫鍵的方式主要有： 隨機(jī)的，僅適用于那些不含游離半胱氨酸殘基的蛋白質(zhì)的重折疊 形成相對(duì)特異，因此適用性較廣，重折疊效果好 HS HS S S + 2e + 2H+ A HS HS SSR HS + B RSSR S S 2RSH 分泌型異源蛋白的表達(dá) 在大腸桿菌中表達(dá)的異源蛋白按其在細(xì)胞中的定位可分為兩種形式：即以可溶性或不溶性（包涵體）狀態(tài)存在于細(xì)胞質(zhì)中；或者通過(guò)運(yùn)輸或分泌方式定位于細(xì)胞周質(zhì)，甚至穿過(guò)外膜進(jìn)入培養(yǎng)基中。在很多情況下， SD序列位于 AUG之前大約 七個(gè)堿基 處，在此間隔中少一個(gè)堿基或多一個(gè)堿基，均會(huì)導(dǎo)致翻譯起始效率不同程度的降低 核糖體結(jié)合位點(diǎn) 核糖體結(jié)合位點(diǎn)對(duì)外源基因表達(dá)的影響 起始密碼子及其后續(xù)若干密碼子的影響 ： 大腸桿菌中的起始 tRNA分子可以同時(shí)識(shí)別 AUG、 GUG和 UUG三種起始密碼子，但其識(shí)別頻率并不相同，通常 GUG為 AUG的 50%而 UUG只及 AUG的 25%。因此， 基因工程中使用的乳糖啟動(dòng) 子均為抗葡萄糖代謝阻遏的 突變型，即 Plac UV5 CAP cAMP cAMP濃度降低 Plac UV5 O 高效轉(zhuǎn)錄 啟動(dòng)子 啟動(dòng)子的可控性 Ptrp 色氨酸啟動(dòng)子 Ptrp的可控性： Otrp 除去 色氨酸 色氨酸啟動(dòng)子 Ptrp受色氨酸 阻遏 蛋白復(fù)合物的阻遏，轉(zhuǎn)錄呈基底 狀態(tài)。由此構(gòu)建的大腸桿菌雙質(zhì)粒系統(tǒng)有效地解除了受體細(xì)胞對(duì)外源基因高效表達(dá)的制約作用 同步表達(dá)相關(guān) tRNA編碼基因 質(zhì)粒拷貝數(shù) 質(zhì)?？截悢?shù)對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)代謝的影響 目前實(shí)驗(yàn)室里廣泛使用的表達(dá)型質(zhì)粒在每個(gè)大腸桿菌細(xì)胞中可達(dá)數(shù)百甚至上千個(gè)拷貝，質(zhì)粒的擴(kuò)增過(guò)程通常發(fā)生在受體細(xì)胞的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)，而此時(shí)正是細(xì)菌生理代謝最旺盛的階段。 因此，只要將細(xì)菌素釋放蛋白編碼基因克隆在一個(gè)合適的質(zhì)粒上 即可構(gòu)建完全分泌型的受體細(xì)胞。隨著重組質(zhì)?？截悢?shù)的不斷增加，受體細(xì)胞內(nèi)的大部分能量和原料被用于合成所有的重組質(zhì)粒編碼蛋白，而細(xì)胞的正常生長(zhǎng)代謝卻因能量不濟(jì)受到影響，因此通過(guò)增加質(zhì)?？截悢?shù)提高外源基因表達(dá)產(chǎn)物的產(chǎn)量往往不能獲得滿意的效果。 相反， N末端含有 Pro、 Glu、 Ser、 Thr的真核生物蛋白質(zhì)，在真核和原核細(xì)胞中的半衰期通常很短 ， 尤其 ProGluSerThr序列 （ PEST序列 ），是胞內(nèi)蛋白酶的超敏感區(qū)。 重組人胰島素的大腸桿菌工程菌的構(gòu)建 A鏈和 B鏈同時(shí)表達(dá)法 tac bGal ori Apr Met Met M M N C B peptide A peptide 化學(xué)合成 AB鏈編碼序列 重組人胰島素 轉(zhuǎn)化 分離純化 CNBr 處理 特異性裂解 體外折疊 重組人胰島素的大腸桿菌工程菌的構(gòu)建 分泌型重組人胰島素表達(dá)法 上述三種重組大腸桿菌的構(gòu)建路線均采用胰島素或胰島素原編碼序列與大腸桿菌 b半乳糖苷酶 基因拼接的方法，所產(chǎn)生的融合型重組蛋白表達(dá)率高、穩(wěn)定性強(qiáng)，但不能分泌，只要以包涵體的形式存在于胞質(zhì)中。 上述思路的技術(shù)路線是：在 pH為 67的有機(jī)相中使胰蛋白酶催 化其逆反應(yīng)，該酶在過(guò)量的蘇氨酸叔丁酯的存在下，將豬胰島素 B 鏈 C末端的丙氨酸交換下來(lái)，所形成的人胰島素叔丁酯再用三氯乙 酸脫去叔丁酯基團(tuán)，最終獲得人胰島素。 在大多數(shù)情況下，重組目的蛋白的不穩(wěn)定性可歸結(jié)為對(duì)受體細(xì)胞蛋白酶系統(tǒng)的敏感性。在實(shí)際生產(chǎn)中，產(chǎn)品主要的成本往往就在該工段 行親和層析，可以快速獲得純度較高的融合蛋白 目的蛋白溶解性好 由于受體蛋白的存在，融合蛋白往往能在 目的蛋白需要回收 融合蛋白需要裂解和進(jìn)一步分離，才能獲 融合型異源蛋白的表達(dá) 融合型目的蛋白表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建 融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建原則： 受體細(xì)胞的結(jié)構(gòu)基因能高效表達(dá)，且其表達(dá)產(chǎn)物可以通過(guò)親和 層析進(jìn)行特異性簡(jiǎn)單純化 兩個(gè)結(jié)構(gòu)基因拼接位點(diǎn)處的序列設(shè)計(jì)十分重要，它直接決定著 為目的蛋白分離回收創(chuàng)造條件 外源基因應(yīng)裝在受體蛋白編碼基因的下游，為融合蛋白提供終 止密碼子。因此，以包涵體形式表達(dá)目的基因操作的關(guān)鍵就是選擇高表達(dá)的載體。 對(duì)于一些終止作用較弱的終止子，通?？梢圆捎枚垠w終止子串聯(lián)的特殊結(jié)構(gòu)，以增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄終止作用 終止子也可以象啟動(dòng)子那樣，通過(guò)特殊的探針質(zhì)粒從細(xì)菌或噬菌體基因組 DNA中克隆篩選 pCP1 Apr ori Tcr 篩選 Apr、 Tcs的轉(zhuǎn)化子 核糖體結(jié)合位點(diǎn) 外源基因在大腸桿菌細(xì)胞中的高效表達(dá)不僅取決于轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)的頻率，而且在很大程度上還與 mRNA的翻譯起始效率密切相關(guān)。但在大型細(xì)菌 培養(yǎng)罐中迅速升溫非常困難，因 此常使用一個(gè)雙質(zhì)?？刂葡到y(tǒng)， 用色氨酸間接控制目的基因表達(dá) Ptrp A B cI857 PL 目的基因 阻遏作用 Ptrp A B PL 表達(dá) 色氨酸 終止子 強(qiáng)化轉(zhuǎn)錄終止的必要性 外源基因在強(qiáng)啟動(dòng)子的控制下表達(dá) ， 容易發(fā)生轉(zhuǎn)錄過(guò)頭現(xiàn)象 ， 即 RNA聚合酶滑過(guò)終止子結(jié)構(gòu)繼續(xù)轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒上鄰近的 DNA序列 ， 形成長(zhǎng)短不一的 mRNA混合物 過(guò)長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄物的產(chǎn)生在很大程度上會(huì)影響外源基因的表達(dá) ， 其原因如下： 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物越長(zhǎng) ， RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄一分子 mRNA所需的時(shí)間就相應(yīng)增加 ， 外源基因本身的轉(zhuǎn)錄效率下降； 如果外源基因下游緊接有載體上的其它重要基因或 DNA功能區(qū)域 ， 如選擇性標(biāo)記基因和復(fù)制子結(jié)構(gòu)等 ， 則 RNA聚合酶在此處的轉(zhuǎn)錄可能干擾質(zhì)粒的復(fù)制及其它生物功能 ， 甚至導(dǎo)致重組質(zhì)粒的不穩(wěn)定性； 過(guò)長(zhǎng)的 mRNA往往會(huì)產(chǎn)生大量無(wú)用的蛋白質(zhì) ， 增加工程菌無(wú)謂的能量消耗； 更為嚴(yán)重的是 ， 過(guò)長(zhǎng)的轉(zhuǎn)錄物往往不能形成理想的二級(jí)結(jié)構(gòu) ， 從而大大降低外源基因編碼產(chǎn)物的翻譯效率 終止子 強(qiáng)終止子的選擇與使用 目前外源基因表達(dá)質(zhì)粒中常用的終止子是來(lái)自大腸桿菌 rRNA操縱子上的rrnT1T2以及 T7噬菌體 DNA上的 Tf。然而，這也是一個(gè)技術(shù)難題，尤其當(dāng)目標(biāo)蛋白分子中的 Cys殘基數(shù)目較高時(shí)，體外復(fù)性蛋白質(zhì)的成功率相當(dāng)?shù)停话悴怀^(guò) 30% 包涵體型異源蛋白的表達(dá) 以包涵體形式表達(dá)目的蛋白的操作 如果未進(jìn)行特殊設(shè)計(jì)（如分泌型表達(dá)或融合型表達(dá)），外源基因在大腸桿菌中表達(dá)的蛋白量占細(xì)胞總蛋白量 20%以上時(shí)，表達(dá)產(chǎn)物一般傾向于形成包涵體。通過(guò)在 DNA水平上人工設(shè)計(jì)引入的蛋白酶切割位點(diǎn)或化學(xué)試劑特異性斷裂位點(diǎn)，可以在體外從純化的融合蛋白分子中釋放回收異源蛋白 融合型異源蛋白的表達(dá) 以融合形式表達(dá)目的蛋白的優(yōu)缺點(diǎn) 目的蛋白穩(wěn)定性高 尤其對(duì)分子量較小的多肽效果更佳 目的蛋白易于分離 利用受體蛋白成熟的抗體、配體、底物進(jìn) 目的蛋白表達(dá)率高 與受體蛋白共用一套完善的表達(dá)元件 胞內(nèi)形成良好的空間構(gòu)象，且大多具有水溶性 目的蛋白。