【正文】 SD序列與起始密碼子之間的精確距離保證了 mRNA在核糖體上定位后，翻譯起始密碼子 AUG正好處于核糖體復(fù)合物結(jié)構(gòu)中的 P位，這是翻譯啟動(dòng)的前提條件。在很多情況下， SD序列位于 AUG之前大約 七個(gè)堿基 處，在此間隔中少一個(gè)堿基或多一個(gè)堿基，均會(huì)導(dǎo)致翻譯起始效率不同程度的降低 核糖體結(jié)合位點(diǎn) 核糖體結(jié)合位點(diǎn)對(duì)外源基因表達(dá)的影響 起始密碼子及其后續(xù)若干密碼子的影響 ： 大腸桿菌中的起始 tRNA分子可以同時(shí)識(shí)別 AUG、 GUG和 UUG三種起始密碼子，但其識(shí)別頻率并不相同，通常 GUG為 AUG的 50%而 UUG只及 AUG的 25%。除此之外，從 AUG開始的前幾個(gè)密碼子堿基序列也至關(guān)重要，至少這一序列不能與 mRNA的 5’ 端非編碼區(qū)形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，否則便會(huì)嚴(yán)重干擾 mRNA在核糖體上的準(zhǔn)確定位 目前廣泛用于外源基因表達(dá)的大腸桿菌表達(dá)型質(zhì)粒上，均含有與啟動(dòng)子來(lái)源相同的核糖體結(jié)合位點(diǎn)序列，序列和間隔是最佳的 密碼子 生物體對(duì)密碼子的偏愛性 不同的生物，甚至同種生物不同的蛋白質(zhì)編碼基因，對(duì)簡(jiǎn)并密碼 子使用頻率并不相同，具有一定的偏愛性，其決定因素是： 生物基因組中的堿基含量 在富含 AT的生物（如單鏈 DNA噬菌體 fX174） 基因組中，密碼子第三位上的 U和 A出現(xiàn)的頻率較高；而在 GC 豐富的生物（如鏈霉菌）基因組中，第三位上含有 G或 C的簡(jiǎn)并密碼子 占 90%以上的絕對(duì)優(yōu)勢(shì) 密碼子與反密碼子相互作用的自由能 性中等強(qiáng)度規(guī)律 細(xì)胞 內(nèi) tRNA的含量 如 GGG、 CCC、 GCG、 GGC、 AAA、 UUU、 AUA、 UAU等使用少； 如 GUG、 CAC、 UCG、 AGC、 ACA、 UGU、 AUC、 UUG等使用多； 密碼子 密碼子偏愛性對(duì)外源基因表達(dá)的影響 由于原核生物和真核生物基因組中密碼子的使用頻率具有較大程 大的差異性，因此外源基因尤其是高等哺乳動(dòng)物基因在大腸桿菌中高 效翻譯的一個(gè)重要因素是密碼子的正確選擇。一般而言，有兩種策略 可以使外源基因上的密碼子在大腸桿菌細(xì)胞中獲得最佳表達(dá)： 外源基因全合成 同步表達(dá)相關(guān) tRNA編碼基因 密碼子 密碼子偏愛性對(duì)外源基因表達(dá)的影響 按照大腸桿菌密碼子的偏愛性規(guī)律，設(shè)計(jì)更換外源基因中不適宜的相應(yīng)簡(jiǎn)并密碼子，重組人胰島素、干擾素以及生長(zhǎng)激素在大腸桿菌中的高效表達(dá)均采用了這種方法 外源基因全合成 密碼子 密碼子偏愛性對(duì)外源基因表達(dá)的影響 對(duì)于那些含有不和諧密碼子種類單一、出現(xiàn)頻率較高、而本身分子量又較大的外源基因而言，則選擇相關(guān) tRNA編碼基因同步克隆表達(dá)的策略較為有利。例如，在 人尿激酶原 cDNA的 412個(gè)密碼子中，共含有 22個(gè) 精氨酸密碼子 ，其中 7個(gè) AGG、 2個(gè) AGA， 而大腸桿菌受體細(xì)胞中 tRNAAGG和 tRNAAGA的豐度較低。為了提高人尿激酶原 cDNA在大腸桿菌中的高效表達(dá)，將大腸桿菌的這兩個(gè) tRNA編碼基因克隆在另一個(gè)高表達(dá)的質(zhì)粒上。由此構(gòu)建的大腸桿菌雙質(zhì)粒系統(tǒng)有效地解除了受體細(xì)胞對(duì)外源基因高效表達(dá)的制約作用 同步表達(dá)相關(guān) tRNA編碼基因 質(zhì)?？截悢?shù) 質(zhì)?？截悢?shù)對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)代謝的影響 目前實(shí)驗(yàn)室里廣泛使用的表達(dá)型質(zhì)粒在每個(gè)大腸桿菌細(xì)胞中可達(dá)數(shù)百甚至上千個(gè)拷貝，質(zhì)粒的擴(kuò)增過程通常發(fā)生在受體細(xì)胞的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)，而此時(shí)正是細(xì)菌生理代謝最旺盛的階段。質(zhì)粒分子的過度增殖以及其后目的基因的高效表達(dá)勢(shì)必會(huì)影響受體細(xì)胞的生長(zhǎng)代謝，進(jìn)而導(dǎo)致重組質(zhì)粒的不穩(wěn)定性以及目的基因宏觀表達(dá)水平的下降 解決上述難題的一種有效策略是將重組質(zhì)粒的擴(kuò)增納入可控制的軌道 質(zhì)?？截悢?shù) 質(zhì)粒擴(kuò)增時(shí)序的控制 pCP3擁有一個(gè)溫度可誘導(dǎo)型的復(fù)制子 pCP3 PL MCS ori Apr 在 28℃ 時(shí)，每個(gè)細(xì)胞的質(zhì)?？截悢?shù)為 60 在 42℃ 時(shí)，拷貝數(shù)迅速增至 300 600 在此溫度下，受體細(xì)胞染色體上的 CI基 因表達(dá)的溫度敏感型阻遏蛋白失活 因此，用一種手段同時(shí)控制質(zhì)?？? 貝數(shù)和基因的表達(dá) C 大腸桿菌基因工程菌的構(gòu)建策略 6 大腸桿菌基因工程 包涵體型異源蛋白的表達(dá) 分泌型異源蛋白的表達(dá) 融合型異源蛋白的表達(dá) 寡聚型異源蛋白的表達(dá) 整合型異源蛋白的表達(dá) 蛋白酶抗性或缺陷型表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建 包涵體型異源蛋白的表達(dá) 包涵體及其性質(zhì) 在某些生長(zhǎng)條件下，大腸桿菌能積累某種特殊的生物大分子，它們致密地集聚在細(xì)胞內(nèi)，或被膜包裹或形成無(wú)膜裸露結(jié)構(gòu)，這種水不溶性的結(jié)構(gòu)稱為 包涵體 （ Inclusion Bodies， IB）。 富含蛋白質(zhì)的包涵體多見于生長(zhǎng)在含有氨基酸類似物培養(yǎng)基的大腸桿菌細(xì)胞中，由這些氨基酸類似物所合成的蛋白質(zhì)往往會(huì)喪失其理化特性和生物功能，從而集聚形成包涵體。由高效表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建的大腸桿菌工程菌大量合成非天然性的同源或異源蛋白質(zhì)，后者在一般情況下也以包涵體的形式存在于細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)。除此之外，包涵體中還含有少量的 DNA、 RNA和脂多糖等非蛋白分子 包涵體型異源蛋白的表達(dá) 以包涵體形式表達(dá)目的蛋白的優(yōu)缺點(diǎn) 能簡(jiǎn)化外源基因表達(dá)產(chǎn)物的分離操作 包涵體表達(dá)形式的優(yōu)點(diǎn)： 包涵體的水難溶性及其密度遠(yuǎn)大于其它細(xì)胞碎片和細(xì)胞成分，菌體經(jīng)超聲波裂解后，直接通過高速離心即可將重組異源蛋白從細(xì)菌裂解物中分離出來(lái) 能在一定程度上保持表達(dá)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定 在形成包涵體之后，大腸桿菌的蛋白酶降解作用基本上對(duì)異源重組蛋白的穩(wěn)定性已構(gòu)不成威脅 包涵體型異源蛋白的表達(dá) 以包涵體形式表達(dá)目的蛋白的優(yōu)缺點(diǎn) 包涵體表達(dá)形式的缺點(diǎn)： 以包涵體形式表達(dá)的重組蛋白喪失了原有的生物活性，必須通過有效的變性復(fù)性操作，才能回收得到具有正確空間構(gòu)象（因而具有生物活性）的目標(biāo)蛋白，因此包涵體變復(fù)性操作的效率對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物的收率至關(guān)重要。然而，這也是一個(gè)技術(shù)難題，尤其當(dāng)目標(biāo)蛋白分子中的 Cys殘基數(shù)目較高時(shí)，體外復(fù)性蛋白質(zhì)的成功率相當(dāng)?shù)停话悴怀^ 30% 包涵體型異源蛋白的表達(dá) 以包涵體形式表達(dá)目的蛋白的操作 如果未進(jìn)行特殊設(shè)計(jì)（如分泌型表達(dá)或融合型表達(dá)），外源基因在大腸桿菌中表達(dá)的蛋白量占細(xì)胞總蛋白量 20%以上時(shí)，表達(dá)產(chǎn)物一般傾向于形成包涵體。因此，以包涵體形式表達(dá)目的基因操作的關(guān)鍵就是選擇高表達(dá)的載體。事實(shí)上，這種高表達(dá)率也是包涵體法的長(zhǎng)處所在 包涵體型異源蛋白的表達(dá) 包涵體的變性與復(fù)性操作 C 共價(jià)修飾的蛋白質(zhì) 蛋白質(zhì)變性復(fù)性的動(dòng)力學(xué)原理： C1 C2 Cn C U I 1 I n N X1 X2 Xn X Ag Ag Ag Ag I 有效變復(fù)性過程中的中間狀態(tài) X 脫離有效變復(fù)性過程而進(jìn)入集聚的中間狀態(tài) N 天然狀態(tài)的蛋白質(zhì) U 變性狀態(tài)的蛋白質(zhì) A 集聚狀態(tài)的蛋白質(zhì) 在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)， 集聚狀態(tài) 和 共價(jià)修飾 的蛋白質(zhì)不能進(jìn)入復(fù)性過程，因此永遠(yuǎn)成為 無(wú)活性的蛋白質(zhì)。包涵體中的蛋白質(zhì)就屬于這兩種狀態(tài)，因此需要在體外進(jìn)行人 工變性（解除共價(jià)修飾和驅(qū)散集聚體）復(fù)性操作 包涵體型異源蛋白的表達(dá) 包涵體的變性與復(fù)性操作 包涵體的溶解與變性： 包涵體的溶解與變性的主要任務(wù)是拆開錯(cuò)配的 二硫鍵 和 次級(jí)鍵 在人工條件下，使包涵體溶解并重新進(jìn)入復(fù)性途徑中。能有效促進(jìn) 包涵體溶解變性的試劑和條件包括： 清洗劑 SDS、 正十二醇肌氨酸，廉價(jià)，但影響復(fù)性和純化 促溶劑 鹽酸胍 、尿素，前者昂貴，尿素便宜，但常被自發(fā) 形成的氰酸鹽污染，后者能與多肽鏈中的氨基反應(yīng) 混合溶劑 如 尿素與醋酸、二甲基砜等聯(lián)合使用，溶解力增強(qiáng) 極端 pH 廉價(jià)，但許多蛋白質(zhì)在極端 pH條件下發(fā)生修飾反應(yīng) 包涵體型異源蛋白的表達(dá) 包涵體的變性與復(fù)性操作 包涵體的復(fù)性與重折疊（ refolding）： 包涵體的復(fù)性與重折疊的主要任務(wù)是： 通過 次級(jí)鍵 的形成使蛋白質(zhì)復(fù)性 將多肽鏈中被拆開的 游離巰基 重新折疊 包涵體型異源蛋白的表達(dá) 包涵體的變性與復(fù)性操作 包涵體的復(fù)性與重折疊（ refolding）： 復(fù)性操作 包涵體復(fù)性操作的方法包括： 分段稀釋法， 逐步降低變性劑的濃度，防止二次集聚的發(fā)生 一步稀釋法， 蛋白復(fù)性與濃度無(wú)關(guān)，但集聚與濃度關(guān)系很大 試劑添加法， 精氨酸、甘氨酸、甘油、蔗糖、 PEG、 Ca2+ 蛋白修飾法， 氨基檸檬酸酐?；?，蛋白帶負(fù)電，抑制集聚 產(chǎn)物隔離法， 將變性的蛋白分子固定化，避免其相互碰撞 分子伴侶法， GroEL、 GroES、 DnaK， 固定化，共表達(dá) 包涵體型異源蛋白的表達(dá) 包涵體的變性與復(fù)性操作 包