【正文】 從而集聚形成包涵體。因此，以包涵體形式表達目的基因操作的關(guān)鍵就是選擇高表達的載體。在變性操作結(jié)束后，這些游離型的巰基必須重新 配對形成二硫鍵，此時多肽鏈也重新發(fā)生折疊。如若將外源基因與大腸 桿菌的 信號肽編碼序列重組在一起，一旦分泌型表達，其 N端 的甲硫氨酸殘基便可在信號肽的剪切過程中被有效除去 分泌型異源蛋白的表達 以分泌形式表達目的蛋白的優(yōu)缺點 分泌表達形式的缺點： 相對其它生物細胞而言，大腸桿菌的蛋白分泌機制并不健全。 融合型異源蛋白的表達 除了直接表達異源蛋白外，還可將外源基因與受體菌自身的蛋白質(zhì)編碼基因拼接在一起，并作為一個開放型 閱讀框架 進行表達。在實際生產(chǎn)中，產(chǎn)品主要的成本往往就在該工段 行親和層析，可以快速獲得純度較高的融合蛋白 目的蛋白溶解性好 由于受體蛋白的存在，融合蛋白往往能在 目的蛋白需要回收 融合蛋白需要裂解和進一步分離，才能獲 融合型異源蛋白的表達 融合型目的蛋白表達系統(tǒng)的構(gòu)建 融合蛋白表達質(zhì)粒的構(gòu)建原則： 受體細胞的結(jié)構(gòu)基因能高效表達，且其表達產(chǎn)物可以通過親和 層析進行特異性簡單純化 兩個結(jié)構(gòu)基因拼接位點處的序列設(shè)計十分重要，它直接決定著 為目的蛋白分離回收創(chuàng)造條件 外源基因應(yīng)裝在受體蛋白編碼基因的下游，為融合蛋白提供終 止密碼子。然而，如果異源蛋白分子內(nèi)部含有甲硫氨酸殘基，則不能用此方法 化學(xué)斷裂法： 融合型異源蛋白的表達 目的蛋白的回收 酶促裂解法： 單殘基位點 蛋白內(nèi)切酶 切割位點 梭菌蛋白酶 ArgC 葡萄球菌蛋白酶 GluC 假單孢菌蛋白酶 LysC 豬胰蛋白酶 ArgC LysC 蛋白酶酶促裂解法的特點是斷裂效率更高， 同時每種蛋白酶均具有相應(yīng)的 斷裂位點決定 簇 ，因此可供選擇的專一性斷裂位點范圍較 廣。由于 Xa的識別作用序列由四個氨基酸殘基組成，大多數(shù)蛋白質(zhì)中出現(xiàn)這種寡肽序列的概率極少，因此這種方法可廣泛用于從融合蛋白中回收各種不同大小的目的蛋白產(chǎn)物 融合型異源蛋白的表達 目的蛋白的回收 酶促裂解法： 多殘基位點 啟動子 受體基因 接頭 目的基因 Met Arg Stop Lys Glu IleGluglyArg Arg Lys Glu IleGluglyArg 表達 親和層析 酶解回收 融合型異源蛋白的表達 目的蛋白的回收 酶促裂解法： 多殘基位點 Pinpoint Xa tac 生物素結(jié)合肽編碼序列 Xa因子識別位點編碼序列 SP6 T7 Apr ori MCS ATC GAA GGT CGC GAA GCT TCA GCT GGG ATC CGG TAC CGA TAT CAG ATC TCC CGG GGC GGC CGC Xa1 Ile Glu Gly Arg Glu ATC GAA GGT CGC GAA AGC TTC AGC TGG GAT CCG GTA CCG ATA TCA GAT CTC CCG GGG CGG CCG C Xa2 ATC GAA GGT CGC GAA AAG CTT CAG CTG GGA TCC GGT ACC GAT ATC AGA TCT CCC GGG GCG GCC GC Xa3 NruI HindIII PvuII BamHI KpnI EcoRV BglII SmaI NotI Xa因子切割位點 寡聚型異源蛋白的表達 從理論上講，外源基因的表達水平與受體細胞中可轉(zhuǎn)錄基因的拷貝數(shù)（即 基因劑量 ）呈正相關(guān)。 串聯(lián)短肽具有與蛋白質(zhì)相似的長度及空間結(jié)構(gòu)，因而抗蛋白酶 降解的能力大幅度提高 寡聚短肽需要裂解和進一步分離，才能獲最終分子，但 裂解后 的短肽分子容易出現(xiàn)序列不均一性 寡聚型異源蛋白的表達 寡聚型目的蛋白表達系統(tǒng)的構(gòu)建 P SD gene gene gene gene T1 T2 H2N COOH Met Met Met Met mRNA CNBr 基本戰(zhàn)略： 寡聚型異源蛋白的表達 寡聚型目的蛋白表達系統(tǒng)的構(gòu)建 構(gòu)建舉例： P SD T1 T2 EcoRI BamHI AATTCAGATCT GTCTAGA G CCTAG EcoRI Bgl II BamHI EcoRI BamHI Bgl II GATCT A G CCTAG EcoRI BamHI Bgl II EcoRI BamHI Bgl II EcoRI + BamHI Bgl II + BamHI BamHI 整合型異源蛋白的表達 以整合形式表達目的蛋白的優(yōu)缺點 目的基因穩(wěn)定表達 整合型的目的基因隨受體細胞染色體 DNA的復(fù)制而復(fù)制，在大 多數(shù)情況下相當(dāng)穩(wěn)定，工程菌在沒有選擇壓力存在下可以連續(xù) 目的基因表達率低 單拷貝整合的目的基因表達率受到限制，此時可通過強化表達 元件而加以補償 培養(yǎng)而不丟失目的基因表達盒，這對以改良物種遺傳性狀為目 的的基因工程案例特別有意義 整合型異源蛋白的表達 DNA體內(nèi)重組的基本原理 在生物體細胞尤其是原核細菌細胞內(nèi)，廣泛存在著 DNA的遺傳重組機制，其可能的生物學(xué)功效是促進生物種群的進化。 在大多數(shù)情況下，重組目的蛋白的不穩(wěn)定性可歸結(jié)為對受體細胞蛋白酶系統(tǒng)的敏感性。 lon的 大腸桿菌突變株可使原來半衰期較短的細菌調(diào)控蛋白（如 SulA、 RscA、 lN） 穩(wěn)定性大增，因此被廣泛用作外源基因高效表達的受體菌。更為重要的是，在多種結(jié)構(gòu)和功能相互獨立的蛋白質(zhì) C末端引入 Asp殘基，都能顯著地延長這些蛋白質(zhì)的半衰期，因此具有普遍意義 。重組質(zhì)粒逃逸的原因有： 高溫培養(yǎng)、表面活性劑（ SDS）、 藥物（利福平）、染料（ 吖啶）促使重組質(zhì)粒滲漏 受體細胞中的核酸酶降解重組質(zhì)粒 重組質(zhì)粒在受體細胞分裂時不均勻分配，細胞所含重組質(zhì)粒 拷貝數(shù)的差異隨著細胞分裂次數(shù)的增多而加劇 改善基因工程菌不穩(wěn)定性的策略 改進載體受體系統(tǒng) 以增大質(zhì)粒穩(wěn)定性為目的的構(gòu)建方法包括： 將 R1質(zhì)粒上的 parB基因引入表達型載體中， 其表達產(chǎn)物可以 選擇性地殺死由于分配不均勻所產(chǎn)生的無質(zhì)粒細胞 正確設(shè)置載體上的多克隆位點， 禁止 DNA片段插在穩(wěn)定區(qū)內(nèi) 將受體細胞的致死性基因安裝在載體上， 同時構(gòu)建條件致死 性的相應(yīng)受體系統(tǒng)，如大腸桿菌的 ssb基因（ DNA單鏈結(jié)合 蛋白編碼基因 改善基因工程菌不穩(wěn)定性的策略 施加選擇壓力 根據(jù)載體上的抗藥性標記，向培養(yǎng)系統(tǒng)中添加相應(yīng)的抗生素 藥物和食品生產(chǎn)時禁止使用抗生素 根據(jù)載體上的營養(yǎng)缺陷型標記，向培養(yǎng)系統(tǒng)中添加相應(yīng)的營 培養(yǎng)基復(fù)雜，成本較高 養(yǎng)組份 改善基因工程菌不穩(wěn)定性的策略 控制目的基因的過量表達 使用可控型啟動子控制目的基因的定時表達及表達程度 使用可控型復(fù)制子控制質(zhì)粒的定時增殖或降低質(zhì)粒的拷貝數(shù) 優(yōu)化基因工程菌的培養(yǎng)工藝 培養(yǎng)基組成： 限制培養(yǎng)基比豐富培養(yǎng)基更有利于穩(wěn)定 培養(yǎng)溫度： 較低的培養(yǎng)溫度有利于重組質(zhì)粒的穩(wěn)定 E 利用重組大腸桿菌生產(chǎn)人胰島素 6 大腸桿菌基因工程 胰島素的結(jié)構(gòu)及其生物合成 人胰島素的生產(chǎn)方法 重組人胰島素的大腸桿菌工程菌的構(gòu)建 胰島素的結(jié)構(gòu)及其生物合成 S S S S C N S S B 肽（ 30） C 肽（ 31） A 肽（ 21） R R R K S S S S C N S S N C 高爾基體內(nèi)的特異性肽酶 N C 信號肽 B 肽 C 肽 A 肽 信號肽酶 人胰島素的生產(chǎn)方法 直接提取法制人胰島素 迄今為止，有四種大規(guī)模生產(chǎn)人胰島素的方法： 早期人的胰島素是從人的胰臟中直接分離純化的，由于原料 供應(yīng)的限制，其產(chǎn)量遠遠不能滿足日益增多的糖尿病人的臨 床需求。 上述思路的技術(shù)路線是：在 pH為 67的有機相中使胰蛋白酶催 化其逆反應(yīng)，該酶在過量的蘇氨酸叔丁酯的存在下，將豬胰島素 B 鏈 C末端的丙氨酸交換下來，所形成的人胰島素叔丁酯再用三氯乙 酸脫去叔丁酯基團，最終獲得人胰島素。 上述由基因工程菌合成的重組人胰島素在體外胰島素 受體結(jié)合 性能 、 淋巴細胞和成纖維細胞的應(yīng)答能力