【正文】 的發(fā)現(xiàn) 載體的使用 逆轉(zhuǎn)錄酶的發(fā)現(xiàn) 第一節(jié) 基因工程的誕生 發(fā)展簡(jiǎn)史 ? 第一個(gè)實(shí)現(xiàn) DNA重組的實(shí)驗(yàn) ① 1972年，美國(guó)斯坦福大學(xué)醫(yī)學(xué)中心的 現(xiàn)了 DNA的體外重組 ②對(duì)猿猴病毒 SV40的 DNA和 λ噬菌體的 DNA進(jìn)行重組 ③“在任何時(shí)候，創(chuàng)新性的思維都是最寶貴的。博德認(rèn)為 ，“生物燃料戰(zhàn)略是一個(gè)威脅人類生存的錯(cuò)誤”， 主張停止生產(chǎn)生物燃料。他先后獲得牛津大學(xué)文學(xué)學(xué)士學(xué)位和倫敦經(jīng)濟(jì)學(xué)院碩士學(xué)位，最后在康奈爾大學(xué)獲得發(fā)展社會(huì)學(xué)博士學(xué)位。 ? 拉吉 在世界上所有國(guó)家，肥胖與饑餓、貧困與富有之間的矛盾正變得日益尖銳。 ? 目前，他受聘為南非夸祖魯 納塔爾大學(xué)研究員，是加州大學(xué)伯克利分校非洲研究中心的訪問學(xué)者。 生物燃料戰(zhàn)略是一個(gè)錯(cuò)誤 ? ? 德國(guó)民間機(jī)構(gòu)“糧食監(jiān)督委員會(huì)”干事長(zhǎng)蒂羅 如果停止其生產(chǎn)，全球就有足夠的糧食儲(chǔ)備，糧價(jià)也不會(huì)暴漲。這樣形成的雜合分子可以在復(fù)制子所在的宿主生物或細(xì)胞中復(fù)制，繼而通過轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，生長(zhǎng)和篩選轉(zhuǎn)化子，無性繁殖使之成為克隆。因此，人類利用基因工程技術(shù)，就有可能根據(jù)需要，通過體外重組，跨越生物種屬間的屏障，改變生物原有的遺傳特性，定向培養(yǎng)或創(chuàng)造新的生物品種 （程備久， 《 現(xiàn)代生物技術(shù)概論 》 ）。 工具酶就其用途而言可分為三大類：限制性內(nèi)切酶 、 連接酶 和 修飾酶 第一節(jié) 限制性核酸內(nèi)切酶（ restriction endonuclease） ? 核酸酶 =核酸外切酶 （ exonuclease） + 核酸內(nèi)切酶 （ endonuclease） 限制性核酸內(nèi)切酶的定義 ? 又簡(jiǎn)稱限制酶或內(nèi)切酶 ，一類能從DNA分子中間水解磷酸二酯鍵，從而切斷雙鏈 DNA的核酸水解酶。 切點(diǎn)數(shù)目＝分子大小（堿基對(duì)數(shù)） 識(shí)別序列頻率 第一節(jié) 限制性核酸內(nèi)切酶（ restriction endonuclease） 四、 Ⅱ 型限制性內(nèi)切酶的基本特性 同裂酶（ isoschizomers） ? 有一些來源不同的限制酶識(shí)別的是同樣的核苷酸靶子序列，這類酶稱為同裂酶。 Bam HⅠ GGATCC CCTAGG G CCTAG GATCC G + BglⅡ AGATCT TCTAGA A TCTAG GATCT A 第一節(jié) 限制性核酸內(nèi)切酶（ restriction endonuclease） 四、 Ⅱ 型限制性內(nèi)切酶的基本特性 稀切酶 ? 有較長(zhǎng)的識(shí)別序列和富含 GC或 AT的識(shí)別序列的限制性核酸內(nèi)切酶。 ? 酶切消化反應(yīng)的溫度 ? 不同的核酸內(nèi)切限制酶，具有不同的最適反應(yīng)溫度 ? 大多數(shù)核酸內(nèi)切限制酶的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)溫度都是 37℃ ，但也有例外的情況 ? DNA的分子結(jié)構(gòu) ? 切割線性分子的效率明顯高于切割超螺旋的質(zhì)粒 DNA或病毒 DNA ? 識(shí)別序列的側(cè)面序列 ? 位點(diǎn)偏愛性 ? 核酸內(nèi)切限制酶的緩沖液 ? 標(biāo)準(zhǔn)緩沖液組份包括： 氯化鎂 、 氯化納或氯化鉀 、 TrisHCl,223。 第二節(jié) DNA連接酶 二、 DNA連接酶的連接機(jī)理 (演示 ) ? 一種封閉 DNA鏈上缺口酶，借助 ATP或NAD水解提供的能量催化 DNA鏈 539。 第二節(jié) DNA連接酶 三、常用的 DNA連接酶 E. coli DNA連接酶 ? 催化片段 互補(bǔ)黏性末端 之間的連接 ? 以 NAD（煙酰胺腺嘌呤二核苷酸，是一種轉(zhuǎn)遞電子的輔酶）作為輔助因子 第二節(jié) DNA連接酶 三、常用的 DNA連接酶 T4 DNA連接酶 ? 不僅能催化片段 互補(bǔ)黏性末端 之間的連接，也能催化雙鏈 DNA平末端 之間的連接 ? 以 ATP（腺嘌呤核苷三磷酸，又叫三磷酸腺苷）作為輔助因子 第二節(jié) DNA連接酶 三、常用的 DNA連接酶 Tsc DNA連接酶 ? 一種能夠在 高溫 下催化兩條 寡核苷酸探針發(fā)生連接作用 的核酸酶 ? 連接酶鏈反應(yīng)（ ligase chain reaction，LCR） 第二節(jié) DNA連接酶 四、 DNA片段的連接方法 互補(bǔ)黏性末端片段之間的連接 ? 既可用 大腸桿菌 DNA連接酶 ，也可用 T4 DNA連接酶 ? 同種限制酶 切開連接后 保留原有切點(diǎn) ； 同尾酶 切開連接后 失去原有的兩種限制性酶的識(shí)別序列 第二節(jié) DNA連接酶 四、 DNA片段的連接方法 平末端片段之間的連接 ? 只能用 T4 DNA連接酶 ，但要增加酶用量 ? 同種限制酶 切開連接后 保留原有切點(diǎn) ； 同尾酶 切開連接后 失去原有的兩種限制性酶的識(shí)別序列 ? 有的新連接片段還可能形成新的限制酶切位點(diǎn) 第二節(jié) DNA連接酶 四、 DNA片段的連接方法 片段末端修飾后進(jìn)行連接 ? DNA片段末端同聚物加尾后連接 ? 黏性末端修飾成平末端后連接 ? DNA片段 5‘端脫磷酸化作用后連接 ? DNA片段加連桿后連接 DNA片段末端 同聚物加尾 后進(jìn)行連接 黏性末端修飾成平末端 后進(jìn)行連接 DNA片段 5‘端脫磷酸化 作用后連接 DNA片段 加連桿 后連接 ? 寡核苷酸連桿（ linker） 是一種按預(yù)先設(shè)計(jì)化學(xué)合成的寡核苷酸片段，一般由 812個(gè)核苷酸組成，具有 一個(gè)或數(shù)個(gè)限制酶識(shí)別位點(diǎn) 的平末端的雙鏈寡核苷酸片段。 第三節(jié) DNA聚合酶 ? DNA聚合酶以 DNA為復(fù)制模板，從 DNA由 5?端點(diǎn)開始復(fù)制到 3‘端的酶。 第三節(jié) DNA聚合酶 三、 T4 DNA聚合酶 ※ 從一種攜帶有高表達(dá) T4 DNA聚合酶質(zhì)粒的大腸桿菌中提純制備 ※ 具有 5′→3′聚合酶活性及 3′→5′外切核酸酶活性 ? T4 DNA聚合酶的主要用途 ① 補(bǔ)平或標(biāo)記限制性內(nèi)切酶消化 DNA后產(chǎn)生的 3′凹端 ， ② 對(duì)帶有 3′突出端的 DNA分子進(jìn)行末端標(biāo)記； ③ 標(biāo)記用作探針的 DNA片段 。 ? 按構(gòu)建克隆載體 DNA的來源分類 ① 質(zhì)粒載體 ② 噬菌體載體 ③ 病毒載體 ④ 質(zhì)粒與病毒或噬菌體 DNA組成的載體 ⑤ 質(zhì)粒與染色體 DNA片段組成的載體 ⑥ 其它克隆載體 ? 按克隆載體的用途分類 ① cDNA克隆載體 ② 轉(zhuǎn)錄載體 ③ 表達(dá)載體 ④ 普通載體 ? 按應(yīng)用對(duì)象分類 ① 原核生物基因克隆載體 ② 酵母基因克隆載體 ③ 植物基因克隆載體 ④ 動(dòng)物基因克隆載體 ? 理想的克隆載體具備的基本條件 ① 針對(duì)受體細(xì)胞的可轉(zhuǎn)移性 ② 自主復(fù)制功能 ③ 多種且單一的限制性內(nèi)切酶切點(diǎn) ④ 容易檢測(cè)的篩選標(biāo)記 ⑤ 載體的分子量適當(dāng) ⑥ 在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定性高 第一節(jié) 質(zhì)粒載體 一、質(zhì)粒的一般生物學(xué)特性 ※ 質(zhì)粒是一種廣泛存在于細(xì)菌細(xì)胞中染色體以外的能自主復(fù)制的裸露的環(huán)狀雙鏈 DNA分子，比病毒更簡(jiǎn)單。 第一節(jié) 質(zhì)粒載體 ② 不親和性 ? 親和性質(zhì)粒： 能在同一細(xì)胞中復(fù)制的幾種質(zhì)粒 不親和性（不相容性）質(zhì)粒： 不能在同一細(xì)胞中復(fù)制的質(zhì)粒 ? 意義： 宿主細(xì)胞內(nèi)的原有質(zhì)粒與克隆載體的質(zhì)粒必須是親和性質(zhì)粒，最好不含內(nèi)源性質(zhì)粒 第一節(jié) 質(zhì)粒載體 ③ 可轉(zhuǎn)移性 在天然條件下 ， 很多天然質(zhì)粒都可以通過細(xì)菌接合作用從一種宿主細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移到另外一種宿主內(nèi) ， 這種轉(zhuǎn)移依賴于質(zhì)粒上的 tra基因產(chǎn)物 。 質(zhì)粒的遷移作用 第一節(jié) 質(zhì)粒載體 ④ 顯性質(zhì)粒和隱蔽質(zhì)粒 宿主因含某種質(zhì)粒而呈現(xiàn)出新的性狀 ， 稱為 顯性 （ 表達(dá)型 ） 質(zhì)粒 。 堿變性法 ? 在 PH值 ～ ，線性的 DNA會(huì)被變性而共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒 DNA卻不會(huì)被變性。） ④加入 150毫升冰冷的 PH= 3M醋酸鈉，振蕩后，冰浴 5分鐘。 烈性噬菌體溶菌生長(zhǎng)的基本過程： 吸附 吸附到位于感染細(xì)胞表面的特殊接受器上 注入 噬菌體 DNA穿過細(xì)胞壁注入寄主細(xì)胞 轉(zhuǎn)變 被感染的細(xì)胞成為制造噬菌體顆粒的場(chǎng)所 合成 大量合成噬菌體特有的核酸和蛋白質(zhì) 組裝 包裝了 DNA頭部和尾部組裝成噬菌體的顆粒 釋放 合成的子代噬菌體顆粒從寄主細(xì)胞內(nèi)釋放出來 噬菌體的溶源生命周期： 溶源生長(zhǎng)周期： 是指在感染過程中沒有產(chǎn)生出子代噬菌體顆粒，噬菌體的 DNA是整合到寄主細(xì)胞染色體 DNA上，成為它的一個(gè)組成部分。 ? 如： λgt10 、 λgt11 λ噬菌體 （四） λ噬菌體載體的類型 ②置換型 （ Replacement vectors） ? 具有兩個(gè)對(duì)應(yīng)的酶切克隆位點(diǎn)，在兩個(gè)位點(diǎn)之間的 λDNA區(qū)段是 λ噬菌體的非必需序列，可以被外源插入的 DNA取代。 采用柯斯質(zhì)粒作載體的不足 ② 大小不等的外源片段相互連接后插入同一個(gè)載體分子，結(jié)果使在基因組內(nèi)本來不是相鄰的片段錯(cuò)亂地連接成一個(gè)片段，會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析 采用柯斯質(zhì)粒作載體的不足 ③ 細(xì)菌的菌落體積遠(yuǎn)大于噬菌斑，因此如用柯斯質(zhì)粒制備基因文庫(kù)，則篩選所需的含某一 DNA片段的菌落很費(fèi)時(shí)間。 pYAC4人工染色體 ? 優(yōu)點(diǎn)： 可以容納更長(zhǎng)的 DNA片段，用較少的克隆就可以包含特定的基因組全部序列，從而保持了基因組特定序列的完整性，有利于物理圖譜的制作。 P1派生人工染色體（ PAC） ? P1派生人工染色體（ PAC）是將BAC和 P1噬菌體載體 二者優(yōu)點(diǎn)結(jié)合起來的克隆體系，可以克隆 100300kb的外源 DNA片段。 ? 可以克隆大于 1000kb的外源 DNA