《基因工程制藥》ppt課件 (2)-預(yù)覽頁
【正文】 不致病、不產(chǎn)生內(nèi)毒素； 容易進行 DNA重組技術(shù)操作； 產(chǎn)物容易提取純化。 原核：以基因組為模板 反轉(zhuǎn)錄 PCR（ RTPCR）： 提取 mRNA， 反轉(zhuǎn)錄生成cDNA作為模板進行 PCR擴增獲得目的基因。第二章 基因工程制藥 基因工程 是將一種生物的基因分離出來，在體外進行酶切和連接插入載體構(gòu)成遺傳物質(zhì)的新組合，導(dǎo)入另一種宿主細(xì)胞使目的基團得到復(fù)制和表達(dá)的技術(shù)。 提取細(xì)胞mRNA 反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA第一鏈 cDNA第二鏈的合成 雜交篩選或其他方式篩選 cDNA文庫 轉(zhuǎn)化特定宿主細(xì)胞 探針 獲取目的基因 cDNA片斷與載體連接 三、 PCR方式 先決條件：已知目的基因的 DNA序列。 一、宿主細(xì)胞的選擇 首要條件： 能夠生產(chǎn)出有活性的目的產(chǎn)物 。 缺點： ? 缺乏翻譯后加工修飾系統(tǒng)，缺少糖基化功能 ； ? 沒有有效釋放蛋白到培養(yǎng)基中的分泌機制 ； ? 表達(dá)的外源蛋白多形成包涵體，蛋白的復(fù)性較困難 ； ? 翻譯目的蛋白 N端常多一個甲硫氨酸殘基（ AUG編碼）。 缺點： 對其分子生物學(xué)研究不深入； 對外源基因表達(dá)的影響因素，特別是分泌機理還需系統(tǒng)研究。 畢赤酵母轉(zhuǎn)錄外源基因的啟動子來自于畢赤酵母 醇氧化酶 I（ AOX1） 的啟動子， 受 甲醇 的嚴(yán)格調(diào)控，可使外源基因高效表達(dá)。 為了最大限度的穩(wěn)定畢赤酵母表達(dá)菌的穩(wěn)定性，已構(gòu)建的畢赤酵母載體均為 整合型載體； 轉(zhuǎn)化前在限制性內(nèi)切酶單酶切位點進行酶切使 載體線形化， 然后轉(zhuǎn)化畢赤酵母，線形化的載體與酵母染色體發(fā)生同源重組插入到染色體中 。 優(yōu)點： 糖基化的基因產(chǎn)物接近或類似于天然產(chǎn)物，可分泌表達(dá)。 高拷貝數(shù)的質(zhì)粒加強菌的代謝負(fù)荷，會影響菌體生長，不利于表達(dá)。 SD位點在翻譯起始階段與 16S rRNA的 339。 AAGGA的間隔為57個核苷酸，而 UAAGGAGG的間隔為 48個核苷酸； ? 對于同一 SD序列，有一翻譯所必需的最小間隔 。 1. 有效的表達(dá)載體 (4) 終止密碼子 在構(gòu)建表達(dá)載體時，通常插入三個終止密碼子以防止核糖體的跳躍。貫穿啟動子的轉(zhuǎn)錄將抑制啟動子的功能，造成所謂的啟動子封堵。 轉(zhuǎn)錄終止子增強 mRNA的穩(wěn)定性并減少了核苷酸在細(xì)胞中的消耗，從而提高蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。末端對 mRNA的降解。 不常用密碼子 氨基酸 AGA,AGG,CGA,CGG Arg UGU,UGC Cys AUA Ile CUA,CUC Leu CCC,CCU,CCA Pro UCA,AGU,UCG,UCC Ser ACA Thr 3. 外源蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)部位 (1) 胞內(nèi)表達(dá) 外源蛋白在大腸桿菌胞內(nèi)高效表達(dá)時通常形成包涵體。 ? 降低誘導(dǎo)強度 。 缺點： 信號肽的存在并不總能保證有效的蛋白質(zhì)通過內(nèi)膜轉(zhuǎn)運。 減少重組蛋白裂解的策略： （ 1）將蛋白質(zhì)靶向細(xì)胞周質(zhì)或培養(yǎng)基； （ 2）選用蛋白酶缺陷的菌株； （ 3）構(gòu)建 N末端或 C末端融合蛋白； （ 4）在較低的溫度下培養(yǎng)細(xì)菌； （ 5）替換特定的氨基酸殘基以消除蛋白酶裂解位點； （ 6）與分子伴侶共表達(dá)； （ 7）優(yōu)化培養(yǎng)條件 5. 融合蛋白 融合表達(dá)具有多方面的 優(yōu)點： 能使外源基因得到有效轉(zhuǎn)譯，防止包涵體的形成，促進蛋白質(zhì)的正確折疊，限制蛋白酶解，利于檢測與純化。 6. 分子伴侶 有效的蛋白質(zhì)翻譯后折疊是由一種被稱為分子伴侶的專職蛋白來
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