《基因工程dna誘變》ppt課件-預覽頁
【正文】 隆突變基因。2+能降低聚合酶對模板的特異性；?增加 dCTP和 dTTP的濃度到 1mM，促進錯誤摻入；?混合寡核苷酸誘變混合寡核苷酸誘變： 若用于取代的是含有隨機突變的混合雙鏈寡核苷酸，則可在限定區(qū)域內(nèi)引入大量的隨機突變。XL18羥基鳥嘌呤在復制時摻入 DNA中，造成突變。烷基磺酸鹽和烷基硫酸鹽 —— 甲基磺酸乙酯（ EMS）、硫酸二乙酯（ DES）2.為胸腺嘧啶（ T）的類似物2氨基嘌呤（ AP） 疊氮化鈉 (NaN3)關(guān)鍵： 引入 DNA片段的重新組裝過程，又稱有性 PCR（ sexual優(yōu)點： 可以將大量突變中的有益突變快速地組合，加速產(chǎn)生 DNA序列多樣性，使定向進化從以往的 “突變 — 選擇 ”模式變?yōu)榕c自然進化更為相似的 “突變 — 重組 — 選擇 ”模式。年首次提出 shuffling技術(shù)的優(yōu)點： ① 可在短時間內(nèi)通過重組有效的突變體發(fā)掘所有可能的重組體與突變序列，從而大大加快進化速度；而且對可操作的靶序列沒有任何要求，長度可達幾十 kb。 它不是由短片段組裝全長基因，而是在 PCR樣反應(yīng)中將含不同點突變的模板混合，隨之進行多輪變性、短暫（ 5sec）復性 /延伸反應(yīng)，在每一輪 PCR循環(huán)中，那些部分延伸的片段可以隨機地雜交到含不同突變的模板上繼續(xù)延伸，由于模板轉(zhuǎn)換而實現(xiàn)不同模板間的重組，這樣重復直到獲得全長基因片段，重組的程度可通過調(diào)整反應(yīng)時間和溫度來控制。vitro第三節(jié) 寡核苷酸介導的定點誘變70年代初 Φx174DNA（ ssDNA對突變體 DNA進行測序，驗證靶點的突變，并確保其他區(qū)域沒有發(fā)生額外的突變。通常以單鏈 DNA為模板，大部分方案利用了 M13噬菌體可制備單鏈 DNA的特點。這樣能夠生長的細胞就帶有突變位點。in選擇性引物可用來恢復有缺陷的抗生素抗性基因，同時可用來選擇引入突變的 DNA鏈。sitedirected因此該方法也稱酶切位點剔除法。四、 PCR介導的定點誘變優(yōu)點：?突變體回收率高；?快速簡便，不需制備單鏈 DNA模板；?高溫的利用可降低模板 DNA形成二級結(jié)構(gòu)的幾率；?所有反應(yīng)可在同一試管進行。PCR)（三）重疊延伸剪接技術(shù)（ splicingSOE）（四）同源重組法（五）雙向 PCR快速定點誘變五、野生型 DNA的篩選和排除限制性內(nèi)切酶 敏感。BAL2+EDTA可抑制其活性三、 DNaseI消化內(nèi)切酶，可優(yōu)先在嘧啶處水解 ds或 ssDNAM
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