基因工程dna誘變ppt課件-資料下載頁
2024-09-20 18:24本頁面
【正文】 也使用了 2個(gè)寡核苷酸引物，除了突變引物外，還使用了 1個(gè)用來剔除單一酶切位點(diǎn)的引物。因此該方法也稱酶切位點(diǎn)剔除法。將待突變的 DNA片段裝載到克隆載體上，該載體上必須存在 1個(gè)單一酶切位點(diǎn)。當(dāng)這兩個(gè)引物同時(shí)指導(dǎo) DNA合成時(shí)，突變的 DNA鏈將不再含有該單一酶切位點(diǎn)，而模板 DNA在該位置能被切割。通過轉(zhuǎn)化大腸桿菌，線性化的模板 DNA不能復(fù)制，只有突變保持環(huán)狀，可以獲得轉(zhuǎn)化子。四、 PCR介導(dǎo)的定點(diǎn)誘變優(yōu)點(diǎn)：?突變體回收率高；?快速簡便，不需制備單鏈 DNA模板；?高溫的利用可降低模板 DNA形成二級結(jié)構(gòu)的幾率；?所有反應(yīng)可在同一試管進(jìn)行。缺點(diǎn)：?PCR擴(kuò)增 DNA時(shí)會產(chǎn)生一定程度的堿基錯(cuò)配；?在擴(kuò)增 DNA的 3’末端加上非預(yù)設(shè)堿基；?對每套引物和模板， PCR反應(yīng)的條件都需要優(yōu)化；?標(biāo)準(zhǔn) PCR不能有效擴(kuò)增大于 3kb的 DNA片段。（一）大引物 PCR誘變（二）重疊延伸 PCR誘變(overlappingextensionPCR)（三）重疊延伸剪接技術(shù)（ splicingbyoverlapextension,SOE）（四）同源重組法（五）雙向 PCR快速定點(diǎn)誘變五、野生型 DNA的篩選和排除限制性內(nèi)切酶 DpnI可特異性切割 dsDNA中的Gm6ATC位點(diǎn)，對半甲基化的 DNA效率較低，完全不能切割非甲基化DNA。大腸桿菌體內(nèi)DNA在 Dam甲基化酶催化下完全甲基化，對DpnI敏感。第四節(jié) 嵌套缺失逐步從感興趣的 DNA的一端或兩端刪除多個(gè)寡核苷酸，得到一套終末端長短不同的嵌套缺失突變體，這個(gè)突變體群體也稱 漸次截短文庫 。?外切核酸酶 Ⅲ （ 3’→ 5’外切核酸酶活性）?BAL31核酸酶 （ 3’→5’ 外切核酸酶活性）?DNaseI（內(nèi)切核酸酶活性）一、外切核酸酶 Ⅲ 的消化二、 BAL31核酸酶消化?主要活性為 3’外切核酸酶活性，可從線性 DNA兩條鏈的 3’端去掉單核苷酸；?具有較弱的單鏈內(nèi)切核酸酶活性；?依賴 Ca2+EDTA可抑制其活性三、 DNaseI消化內(nèi)切酶，可優(yōu)先在嘧啶處水解 ds或 ssDNAMg2+：獨(dú)立作用于每條 DNA鏈，切點(diǎn)隨機(jī)Mn2+：大致在同一位置切割 dsDNA產(chǎn)生平端或 12個(gè)核苷酸突出
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