《基因工程實(shí)驗(yàn)流程》ppt課件-預(yù)覽頁(yè)
【正文】 （用 500ul的 EP管裝），加完之后混勻，短時(shí)離心，用封口膠封口。 再在冰上放 10min， 然后導(dǎo)入 SOC（ ） 中 ，在 37OC搖床上 200rpm進(jìn)行振蕩一小時(shí) 。 注意不可將沉淀倒出 。 3. 對(duì)于得到的質(zhì)粒再酶切電泳檢測(cè)陽(yáng)性克隆 ， 如果酶切后的電泳圖上出現(xiàn)了與插入片斷相應(yīng)大小的條帶 ， 證明是此單菌落是陽(yáng)性克隆 ，否則是假陽(yáng)性的 。 ? 將帶有膜的管子轉(zhuǎn)移到新的 EP管中 ， 加入 100微升的水 ， 靜置 1分鐘 ，10000r/min離心 1分鐘 ， 即得到所需要的質(zhì)粒 。最后在恒溫?fù)u床中洗膜（探針標(biāo)記：放射性和非放射性） ? 將噬菌體培養(yǎng)于平板，于 42℃ 培養(yǎng)幾小時(shí)后，于 37℃ 用 IPTG誘導(dǎo)融合蛋白的表達(dá)并印記于尼龍膜上，利用抗原 抗體反應(yīng)進(jìn)行雜交 ? 利用 GSP（基因特異引物）通過(guò) PCR擴(kuò)增出目標(biāo)基因 ? 利用 GSP，以文庫(kù)為模板通過(guò) PCR擴(kuò)增出目標(biāo)基因，并通過(guò)電泳、凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)。 ? 水稻基因組 DNA的提取、純化和分析 ? 水稻各器官 Total RNA的提取、純化和分析 質(zhì)粒提取、分析 ? 常規(guī)質(zhì)粒提取方法：通過(guò)細(xì)菌的適當(dāng)裂解釋放出質(zhì)粒，利用酚和氯仿抽提掉蛋白，再利用無(wú)水乙醇沉淀質(zhì)粒 DNA ? 質(zhì)粒提取試劑盒：裂解方法一致。 ⑵ 10μL體積反應(yīng)體系中： 2 快速連接緩沖液 5μL 目的基因的雙酶切產(chǎn)物 XμL pMalc2x質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物 XμL T4DNA連接酶 ⑶ 輕輕混勻，室溫下放置過(guò)夜。 （ 4） 以 4000r/min在 4℃ 離心 10min， 棄去上清 ， 每 50mL初始培養(yǎng)物用 2mL預(yù)冷的含有 10%~20%甘油的 ， 100μL/管分裝 ，于 70℃ 條件下 ， 可保存半年 。 （ 3）向 EP管加入 900 μL LB培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)移至 37℃ 搖床上， 150r/min，溫育 45 min以復(fù)蘇菌株。 加入 200 ?l Solution II， 立即溫和混勻 （ 傾斜 45度角 ，順一個(gè)方向 ， 慢慢旋轉(zhuǎn)離心管 ） ， 使細(xì)菌裂解 ， 室溫放置 2分鐘 。棄收集管中的廢液 ， 將 UNIQ10柱放入同一支收集管中 ， 吸取 500?l Wash Solution到UNIQ10柱 ， 10,000rpm室溫離心 30秒 。 離心管中的溶液即為所抽提的質(zhì)粒 DNA。不要吸取沉淀，否則會(huì)出現(xiàn)基因組 DNA和蛋白質(zhì)污染。 按下列體系配制反應(yīng)混合液，混勻， Template DNA μL（ 20 ng ） 10 buffer μL MgCl2（ 25mmol/L） μL Primer 1 (10μmol/L) μL Primer 2 (10μmol/L) μL dNTPs （ 2mmol/L） μL Taq酶 （ 5U/μL） 加 ddH2O至 20μL 外源基因的特異引物：引物 1（ 5`CCG GAA TTC TTG AAT AAA GAA GCG CTA GTC— 3`）和引物 2（ 5`CGG GGA TCC GTC GAC TTA TTG CAG TGA TAT GTG TTG— 3`）。 檢測(cè) 加 2μL溴酚藍(lán)和 10μL 反應(yīng)產(chǎn)物 ， 混勻 ， 取 15μL 反應(yīng)產(chǎn)物點(diǎn)樣電泳 。端添加T 而成 。前述的不管是哪種類(lèi)型的 cDNA 文庫(kù)，都可以用于分離新基因，只是使用的方法有差異。(539。該法的主要特是利用一條根據(jù)已知序列設(shè)計(jì)的特異性引物和一條與 mRNA 的 PolyA (339。端內(nèi)加入一內(nèi)切酶位點(diǎn)。當(dāng) RACE PCR 產(chǎn)物為復(fù)雜的混合物時(shí)，可取部分產(chǎn)物作模板，用另一條位于原引物內(nèi)側(cè)的序列作為引物與通用引物配對(duì)進(jìn)行另一輪 PCR (巢式 PCR )。 ? 用 PCR 法從 cDNA 文庫(kù)中快速 克隆 基因 通過(guò)對(duì)文庫(kù)的篩選或適用簡(jiǎn)并引物進(jìn)行 PCR 反應(yīng)，常常只能獲得不完整的 cDNA 片段。特別是在基因的兩端變異較大而中間某區(qū)域保守的情況下，用 PCR 法很容易獲取 cDNA 的全長(zhǎng)。以此篩選出陽(yáng)性克隆，進(jìn)行序列分析，以獲得 cDNA 全長(zhǎng)。用于做標(biāo)記探針的 DNA 片段可以是其它生物的基因片段，在這種情況下篩選出來(lái)的基因往往是已分離基因的同源基因；如果用于做標(biāo)記探針的 DNA 片段是通過(guò)新分離蛋白質(zhì)的氨基酸反推設(shè)計(jì)的 DNA 序列，或者是特異分子標(biāo)記子 DNA 序列，那么可以篩選得到新功能基因。 采集 5個(gè)自愿者的 DNA樣品 構(gòu)建 3種不同插入子大小的基因組文庫(kù) 2Kb, 10Kb和 50Kb 完成約 2700萬(wàn)次插入子末端測(cè)序 ,總長(zhǎng) 14800Mb GeneBank下載104018個(gè) BAC末端順序 PFP發(fā)表的公開(kāi)數(shù)據(jù)主要為 BAC克隆的順序 ,共 隨機(jī)測(cè)序與序列組裝方法和 指導(dǎo)測(cè)序與序列組裝方法 相結(jié)合進(jìn)行序列組裝
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