《基因工程實驗流程》ppt課件-全文預(yù)覽
【正文】 原理提取基因組 DNA ? 利用酚 氯仿抽提或過濾柱純化基因組 DNA ? 水稻基因組文庫的構(gòu)建 ? 利用特異的探針，通過 Southern blotting檢測目標(biāo)基因的拷貝數(shù) 水稻各器官 Total RNA的提取、純化和分析 ? 分離所需的水稻各器官組織，并利用 Qiagen的 RNeasy系列試劑盒提取總 RNA：將材料裂解后，通過過濾柱純化出總RNA ? 在 RNasefree的情況下，通過甲醛變性膠電泳檢測總 RNA的質(zhì)量 ? 利用特異性的探針，通過 Northern blotting檢測目標(biāo)基因在各器官的表達(dá)情況 Southern blotting 基因組 DNA完全消化 探針制備 瓊脂水平電泳 比活性測定 印跡轉(zhuǎn)膜 DNA交聯(lián) 限制性內(nèi)切酶、恒溫水浴鍋 手提紫外燈、電泳儀器 真空轉(zhuǎn)膜儀 紫外交聯(lián)儀 同位素檢測儀 探針制備試劑盒 尼龍膜 制備好的尼龍膜 探針（放射性或非放射性） 雜交 雜交箱 放射自顯影 熒光 同位素檢測儀 磷屏成像系統(tǒng) 熒光掃描 成像系統(tǒng) 克隆化基因的表達(dá)及表達(dá)蛋白的純化和功能分析 ? 克隆化基因的表達(dá) ? 表達(dá)蛋白的純化 ? 功能分析 克隆化基因的表達(dá) ? 基因的克?。豪酶弑Ｕ娴?Taq酶和合適的反應(yīng)系統(tǒng)，通過 PCR獲得與目標(biāo)基因完全一致的 DNA片段（通過測序確證） ? 體內(nèi)表達(dá)：選擇合適的表達(dá)載體插入目標(biāo)片段。利用文庫載體序列和已知的目標(biāo)基因的序列設(shè)計通用引物和 GSP，通過 5’RACE和 3’RACE擴增出目標(biāo)基因的 5’和 3’端序列。 ? 獲得的陽性單克隆送樣測序，測序結(jié)果的同源性比較采用GenBank中的 BLAST分析程序，基因序列比較運用 DNAsist軟件。 試劑盒質(zhì)粒回收過程 ? 把過夜培養(yǎng)菌液 ， 10000r/min離心 1分鐘 ， 倒掉上清液； ? 向菌體中加入質(zhì)?；厥赵噭┖兄械?SolutionI400微升 ， 震蕩 ， 直到沉淀的菌體完全懸浮； ? 然后加入 400微升的 SolutionII， 輕輕地顛倒混勻 ， 然后在室溫下放置 2分鐘； ? 加入 525微升的 SolutionIII， 顛倒混勻 ， 直到出現(xiàn)白色的絮狀沉淀 ，10000r/min離心 10分鐘； ? 把上清液轉(zhuǎn)移到試劑盒專用管中 ， 10000r/min離心 1分鐘 。 ? 5. 用移液槍將沉淀吹散均勻 ， 將其加入事先倒好的平板上 ， 加入涂布玻璃珠進行涂布 。 ? 3. 在這段時間里可以準(zhǔn)備平板 ， 25ml左右加了抗生素的 60度左右的 LB固體培養(yǎng)基倒入事先滅菌的培養(yǎng)皿中 ， 在表面涂布上 Xgal和 ITPG。將 EP管放入金屬浴當(dāng)中 16度連接過夜。此樣品可用來做酶切等。 8) 將電泳的凝膠浸入溴化乙錠染色液中 ， 染色 10min后取出 ， 用清水沖洗 。 4) 待膠凝固后 ， 取出梳子 ， 放在電泳槽內(nèi) 。一 TTAAAGTGGCTTTCCACTTGTC一 339。 ? 加入二倍體積預(yù)冷的無水乙醇 ， 20℃ 下沉淀 10min ， 4,000rpm離心 3min，加適量 70%乙醇洗沉淀 ， 自然干燥或 37℃ 烘干 ， 加入 50ul ddH2O溶解備用 。 ? 實驗?zāi)康? 通過本綜合實驗 ， 掌握植物基因組 DNA的制備技術(shù) 、 PCR技術(shù) 、 限制性內(nèi)切酶酶切技術(shù) 、 重組 DNA技術(shù) 、 克隆鑒定技術(shù) 、 質(zhì)粒 DNA的制備 、 瓊脂糖凝膠電泳技術(shù) 、 測序技術(shù) 、 生物信息技術(shù)等 ， 得到一個與科學(xué)研究過程相近的分子生物學(xué)綜合技能訓(xùn)練 。 油菜 TOC33基因片的克隆 ? 實驗項目背景 國家自然科學(xué)基金項目 （ 油菜葉綠體蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運突變體中差異表達(dá)基因的克隆 ， 編號： 30170500） 。 ? 沉淀用 50ul TERNase（ pH ， EDTA pH ，RNase A 30ug/mL） 溶解 ， 37℃ 保溫處理 15min。 下游引物 P2： 539。 3) 將冷到 60oC左右的瓊脂糖凝膠液 ， 緩緩倒入膠板 ， 直至膠板上形成一層均勻的膠面 。 6) 接通電泳槽和電泳儀的電源 （ 注意正負(fù)極 ， DNA片段從負(fù)極向正極移動 ） ；選擇合適的電壓 ， 開始電泳； 7) 當(dāng)溴酚藍(lán)燃料移動倒距離凝膠前言 1－ 2cm處 ， 停止電泳 。然后把溶液轉(zhuǎn)移到試劑盒專用管中， 6000轉(zhuǎn) /分離心 1分鐘； ? 倒掉上清，再加入 500微升的 extraction buffer,12022r/min離心 1分鐘； ? 倒掉上清，加入 750微升的 wash buffer ,12022r/min離心 1分鐘； ? 倒掉上清，重復(fù)步驟三； ? 倒掉上清，在 12022r/min下空轉(zhuǎn) 1分鐘； ? 把帶有膜的管子換到新的 EP管中，加入 30~50微升的水，靜置 1分鐘，12022r/min離心一分鐘，即得到所要回收的片斷。 酶切體系： ddH2O 10 Buffer DNA Xba I、 Hind III ? 連接反應(yīng)： 連接體系： （ ） 酶切產(chǎn)物 Buffer 載體 Liagse 加試劑順序由上到下
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