《基因工程制藥》ppt課件 (2)-全文預(yù)覽
【正文】 機磷調(diào)節(jié)（低磷誘導(dǎo)） 分泌信號： 可利用異源分泌信號 ， 酵母自身分泌信號優(yōu)于其他生物的分泌信號 終止序列： 保證 mRNA在適當(dāng)部位終止 ， 加 polyA, 增強 mRNA穩(wěn)定性 3. 外源蛋白的糖基化 N糖鏈 （ 天冬酰胺 ） O糖鏈 （ 絲氨酸 、 蘇氨酸 ） 與天然產(chǎn)物類似 ， 不完全相同 4. 宿主菌株的影響 生長能力強 內(nèi)源蛋白酶較弱 菌株性能穩(wěn)定 （ 突變株 ， 使用二倍體或多倍體 ） 分泌能力強 。 原核分子伴侶（ GroES、 GroEL、 DnaK、 HtpG） 能穩(wěn)定表達的蛋白折疊中間體，可提高正確折疊的蛋白質(zhì)的產(chǎn)量。 成功應(yīng)用的融合擔(dān)體蛋白： 谷胱甘肽 S轉(zhuǎn)移酶（ GST） 、 麥芽糖結(jié)合蛋白（ MBP） 以及 硫氧還蛋白（ Trx） 等。 (3) 胞外表達 胞外表達優(yōu)點： ? 可簡化蛋白質(zhì)的純化； ? 減少蛋白酶對目的蛋白質(zhì)的降解 然而目前還未完全闡明大腸桿菌外分泌的機理，迄今為止還未設(shè)計出切實可行的在胞外制備大量外源蛋白的方案。 ? 選擇不同的 表達 菌株 。 包涵體表達優(yōu)點 ：易分離、可免受胞內(nèi)酶降解。 2. 密碼子偏好性 ： （ 1）對于絕大多數(shù)的簡并密碼子中的一個或兩個具有偏好； （ 2）某些密碼子對所有不同的基因都是最常用的，例如 CCG是脯氨酸最常用的密碼子； （ 3）高度表達的基因比低表達的基因表現(xiàn)更大程度的密碼子偏好； （ 4）同義密碼子的使用頻率與相應(yīng)的 tRNA含量有高度相關(guān)性。 1. 有效的表達載體 (6) mRNA的穩(wěn)定性 mRNA的快速降解會影響蛋白質(zhì)的產(chǎn)生，提高mRNA穩(wěn)定性有利于提高外源基因的表達。 在編碼序列下游的適當(dāng)位置放置一轉(zhuǎn)錄終止子，可阻止轉(zhuǎn)錄貫穿別的啟動子。在 UAA密碼子，尤其當(dāng)其后存在一個 U形成 UAAU時其轉(zhuǎn)錄終止效率最有效 。 在 mRNA的翻譯起始區(qū)的二級結(jié)構(gòu)在決定基因表達效率方面具有重要作用： ? 提高 RBS中 A、 T殘基的豐度能增強某些基因的表達； ? 突變 SD區(qū)上游或下游的某些特定核苷酸會抑制 mRNA二級結(jié)構(gòu)的形成和提高翻譯效率； ? 位于起始密碼子下游的密碼子堿基組成，同樣會影響mRNA 539。端互補結(jié)合。 1. 有效的表達載體 (2) 啟動子 大腸桿菌啟動子由 10區(qū)和 35區(qū)組成，兩者之間通常間隔 16~18個核苷酸。 缺點： 生長速度慢，培養(yǎng)條件苛刻，成本高。 常用載體： 非分泌載體（ pAO81 pPIC3K、 pPICZ等） 分泌型載體（ pPIC9K、 pPICZα等） （ 2）絲狀真菌 近年來在 30種以上 絲狀真菌中建立了 DNA轉(zhuǎn)化體系 。 畢赤酵母的特點： 為真核表達體系，可進行翻譯后修飾； 表達量高，明膠的表達量可達 。 ? 真核表達系統(tǒng) （ 1）酵母 單細(xì)胞生物，無毒，易培養(yǎng)，繁殖快。 （ 2）枯草芽孢桿菌 革蘭氏陽性菌，其基因組測序已經(jīng)完成。 其他條件： 容易獲得較高濃度的細(xì)胞； 產(chǎn)物的產(chǎn)量、產(chǎn)率高； 能利用易得廉價原料；
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