基因工程制藥ppt課件(2)-文庫吧資料
2025-01-11 09:17本頁面
【正文】 利于目的蛋白的純化； ? 有利于蛋白質(zhì)的正確折疊； ? 有可能產(chǎn)生目的蛋白的天然 N末端； ? 蛋白質(zhì)降解少 成功應(yīng)用的信號肽： PhoA、 OmpA、 OmpT、LamB和 OmpF以及金黃色葡萄球菌的 A蛋白，胡蘿卜歐氏桿菌的 PelB的信號肽等。 ? 選擇不同的 表達 菌株 。 3. 外源蛋白在大腸桿菌中的表達部位 (1) 胞內(nèi)表達 幫助蛋白質(zhì)形成天然空間結(jié)構(gòu)的策略 ： ? 較低溫度下培養(yǎng) 。 包涵體表達優(yōu)點 ：易分離、可免受胞內(nèi)酶降解。 對策： （ 1）常用密碼子替換稀有密碼子； （ 2）與 “ 稀有 ” tRNA基因共表達。 2. 密碼子偏好性 ： （ 1）對于絕大多數(shù)的簡并密碼子中的一個或兩個具有偏好； （ 2）某些密碼子對所有不同的基因都是最常用的，例如 CCG是脯氨酸最常用的密碼子； （ 3）高度表達的基因比低表達的基因表現(xiàn)更大程度的密碼子偏好； （ 4）同義密碼子的使用頻率與相應(yīng)的 tRNA含量有高度相關(guān)性。 UTR序列及保護性的發(fā)卡結(jié)構(gòu)，因而能夠阻斷外切核酸酶從 339。 1. 有效的表達載體 (6) mRNA的穩(wěn)定性 mRNA的快速降解會影響蛋白質(zhì)的產(chǎn)生，提高mRNA穩(wěn)定性有利于提高外源基因的表達。 1. 有效的表達載體 (5) 轉(zhuǎn)錄終止子 由強啟動子啟動的轉(zhuǎn)錄會使轉(zhuǎn)錄通讀到復(fù)制區(qū)，造成控制質(zhì)?？截悢?shù)的 ROP蛋白的過量表達，導(dǎo)致質(zhì)粒的不穩(wěn)定。 在編碼序列下游的適當(dāng)位置放置一轉(zhuǎn)錄終止子，可阻止轉(zhuǎn)錄貫穿別的啟動子。 有效的轉(zhuǎn)錄終止子是表達載體必不可少的元件。在 UAA密碼子，尤其當(dāng)其后存在一個 U形成 UAAU時其轉(zhuǎn)錄終止效率最有效 。端，使其 A、 T含量增加，減少 mRNA二級結(jié)構(gòu)增加翻譯效率。 在 mRNA的翻譯起始區(qū)的二級結(jié)構(gòu)在決定基因表達效率方面具有重要作用： ? 提高 RBS中 A、 T殘基的豐度能增強某些基因的表達； ? 突變 SD區(qū)上游或下游的某些特定核苷酸會抑制 mRNA二級結(jié)構(gòu)的形成和提高翻譯效率； ? 位于起始密碼子下游的密碼子堿基組成，同樣會影響mRNA 539。UAAGGAGG的 SD序列比 AAGGA的 SD序列能使蛋白質(zhì)的產(chǎn)量提高 36倍； ? 對于同一 SD序列，存在一最佳的間隔。端互補結(jié)合。 質(zhì)粒 啟動子 誘導(dǎo)方式 提供商 pBV220 λPLPR串聯(lián)啟動子 42度熱誘導(dǎo) pET系列 T7 IPTG Novagen pThioHisA,B,C trc IPTG Invitrogen pBAD系列 araBAD L阿拉伯糖 Invitrogen pQE系列 T5 IPTG Qiagen pGEX系列 tac IPTG GE 1. 有效的表達載體 (3) 核糖體結(jié)合位點（ RBS） 與翻譯起始 RBS是翻譯開始時核糖體 30S小亞基識別并結(jié)合的mRNA 部位，包括起始密碼子及其上游 313堿基處長度為 39個核苷酸的 SD序列。 1. 有效的表達載體 (2) 啟動子 大腸桿菌啟動子由 10區(qū)和 35區(qū)組成，兩者之間通常間隔 16~18個核苷酸。 p G E X 3 X4 95 2 b pA m p ( r )l a c I qG S TS t a r t c o d o n ( A T G ) f o r G S TC o d i n g r e g i o n f o r f a c t o r X a c l e a v a g el a c o p e r a t o rr b so r iR e g i o
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