基因工程制藥ppt課件(2)-wenkub
2023-01-20 09:17:35 本頁(yè)面
【正文】 主 上、下游 目的基因的獲得 一、構(gòu)建基因文庫(kù) 提取細(xì)胞基因組 DNA 酶切 克隆至特定載體 雜交或其他方式篩選 基因文庫(kù) 轉(zhuǎn)化特定宿主細(xì)胞 探針 (如根據(jù)氨基酸序列反推過(guò)來(lái)的DNA序列，根據(jù)蛋白保守性得到的同源序列，已知的部分 DNA序列 ) 獲取目的基因 適合于無(wú)內(nèi)含子的原核生物 二、構(gòu)建 cDNA文庫(kù) 適合于真核生物基因克隆。 基因表達(dá) 基因表達(dá)： 結(jié)構(gòu)基因在生物體中的轉(zhuǎn)錄、翻譯及所有的加工過(guò)程。 革蘭氏陰性菌 優(yōu)勢(shì)： 遺傳背景清楚，基因組序列已確定； 生長(zhǎng)迅速，平均 20~30min繁殖一代； 易于培養(yǎng)，生產(chǎn)成本低，適合大規(guī)模培養(yǎng)； 外源基因表達(dá)水平高，可達(dá)總蛋白的 5~30％以上； 有大量可供選擇利用的克隆和高效表達(dá)載體。 （ 3）鏈霉菌 優(yōu)點(diǎn)： 對(duì)人畜基本無(wú)致病性； 已發(fā)展了一大批有實(shí)用價(jià)值的載體質(zhì)粒； 鏈霉菌的模式菌株天藍(lán)色鏈霉菌的基因組測(cè)序已完成； 具有很強(qiáng)的外分泌能力； 表達(dá)蛋白基本能正確折疊，不形成包含體； 具有糖基化功能 為重要的工業(yè)微生物，下游培養(yǎng)工藝成熟。 以往多采用 釀酒酵母（ Saccharomyces cerevisiae） 作為表達(dá)系統(tǒng)，近年來(lái)采用 畢赤酵母（ Pichia pastoris） 表達(dá)蛋白增多。 雜蛋白較少，產(chǎn)物純化容易。 （ 4）哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng) 以中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞（ CHO） 和非洲綠猴腎細(xì)胞（ COS） 細(xì)胞使用最多。 p G E X 3 X4 95 2 b pA m p ( r )l a c I qG S TS t a r t c o d o n ( A T G ) f o r G S TC o d i n g r e g i o n f o r f a c t o r X a c l e a v a g el a c o p e r a t o rr b so r iR e g i o n n e c e s s a r y f o r r e p l i c a t i o nt a c p r o m o t e r 1 0P r o m o t e r 1 0t a c p r o m o t e r 3 5P r o m o t e r 3 5A v a I ( 9 4 0 )Ba m H I ( 93 5 )Ec o R I ( 94 5 )P s t I ( 1 90 6)S m a I ( 9 4 2 )X m a I ( 9 4 0 )A p a L I ( 1 9 )A p a L I ( 1 4 7 6 )A p a L I ( 2 7 2 2 )A p a L I ( 3 6 3 2 )1. 有效的表達(dá)載體 (1) 載體的復(fù)制 松弛型的載體可增加基因的拷貝數(shù)，有利于外源基因表達(dá)。 質(zhì)粒 啟動(dòng)子 誘導(dǎo)方式 提供商 pBV220 λPLPR串聯(lián)啟動(dòng)子 42度熱誘導(dǎo) pET系列 T7 IPTG Novagen pThioHisA,B,C trc IPTG Invitrogen pBAD系列 araBAD L阿拉伯糖 Invitrogen pQE系列 T5 IPTG Qiagen pGEX系列 tac IPTG GE 1. 有效的表達(dá)載體 (3) 核糖體結(jié)合位點(diǎn)（ RBS） 與翻譯起始 RBS是翻譯開(kāi)始時(shí)核糖體 30S小亞基識(shí)別并結(jié)合的mRNA 部位，包括起始密碼子及其上游 313堿基處長(zhǎng)度為
教學(xué)課件相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號(hào)-1