基因工程制藥ppt課件(2)-資料下載頁
2025-01-05 09:17本頁面
【正文】 進(jìn)蛋白質(zhì)的正確折疊，限制蛋白酶解，利于檢測(cè)與純化。 成功應(yīng)用的融合擔(dān)體蛋白： 谷胱甘肽 S轉(zhuǎn)移酶（ GST） 、 麥芽糖結(jié)合蛋白（ MBP） 以及 硫氧還蛋白（ Trx） 等。 融合表達(dá)一般都有方便的純化方法（ GST 融合蛋白 可采用谷胱甘肽 sepharose親和柱進(jìn)行純化，帶 組氨酸標(biāo)簽 的融合蛋白采用 金屬螯合層析 純化）。 缺點(diǎn)： 對(duì)融合蛋白進(jìn)行位點(diǎn)特異性裂解。 6. 分子伴侶 有效的蛋白質(zhì)翻譯后折疊是由一種被稱為分子伴侶的專職蛋白來介導(dǎo)的。 原核分子伴侶（ GroES、 GroEL、 DnaK、 HtpG） 能穩(wěn)定表達(dá)的蛋白折疊中間體，可提高正確折疊的蛋白質(zhì)的產(chǎn)量。 缺點(diǎn)： 適用性較差，大多數(shù)情況下即使是共表達(dá)分子伴侶也難獲得高效表達(dá)的可溶蛋白產(chǎn)物。 三 、 酵母體系中的基因表達(dá) 表達(dá)系統(tǒng)： 載體 、 宿主細(xì)胞 （ 一 ） 表達(dá)載體 1. 載體的復(fù)制序列 四大類： （ 1） YEp類 (yeast episomal plasmid,酵母附加體質(zhì)粒 ) 復(fù)制序列來源于 酵母 2μ質(zhì)粒 拷貝數(shù)： 5~50 高拷貝數(shù)： 100~200 穩(wěn)定性高 （ 2） YRp類 (yeast replicating plasmid,酵母復(fù)制型質(zhì)粒 ) 復(fù)制序列來源于 非 2μ質(zhì)粒的自主復(fù)制序列 (ARS) 如酵母染色體 拷貝數(shù)： 5~10 穩(wěn)定性差 （ 3） YCp類 (yeast centromeric plasmid,酵母著絲粒質(zhì)粒 ) 復(fù)制序列：含 酵母染色體復(fù)制序列 及 酵母染色體中心粒成分 ， 有的含酵母染色體端粒 類似染色體 ， 參與細(xì)胞有絲分裂和減數(shù)分裂 拷貝數(shù)： 1 穩(wěn)定性好 （ 4） YIp類 (yeast integrative plasmid,酵母整合型質(zhì)粒 ) 含可與酵母染色體重組的 同源序列 整合到染色體上 ， 依靠染色體復(fù)制而復(fù)制 拷貝數(shù)少 (1個(gè)或少數(shù)幾個(gè) ) 穩(wěn)定 2. 穿梭載體 可在 大腸桿菌 和 酵母 中復(fù)制 含大腸桿菌質(zhì)粒 pBR322復(fù)制序列 和 抗生素抗性基因 酵母中選擇性標(biāo)記： 抗性基因 或某些 氨基酸或核苷酸合成酶基因 3. 表達(dá)載體 含酵母啟動(dòng)子和終止子 胞內(nèi)表達(dá)載體 分泌表達(dá)載體 （ 含信號(hào)肽序列 ， α因子 ） （ 二 ） 影響目的基因在酵母中表達(dá)的因素 1. 外源基因的劑量 拷貝數(shù) 穩(wěn)定性 對(duì)菌生長(zhǎng)的影響 2. 外源基因的表達(dá)效率 啟動(dòng)子 、 終止序列 、 分泌信號(hào) PHO5啟動(dòng)子 無機(jī)磷調(diào)節(jié)（低磷誘導(dǎo)） 分泌信號(hào)： 可利用異源分泌信號(hào) ， 酵母自身分泌信號(hào)優(yōu)于其他生物的分泌信號(hào) 終止序列： 保證 mRNA在適當(dāng)部位終止 ， 加 polyA, 增強(qiáng) mRNA穩(wěn)定性 3. 外源蛋白的糖基化 N糖鏈 （ 天冬酰胺 ） O糖鏈 （ 絲氨酸 、 蘇氨酸 ） 與天然產(chǎn)物類似 ， 不完全相同 4. 宿主菌株的影響 生長(zhǎng)能力強(qiáng) 內(nèi)源蛋白酶較弱 菌株性能穩(wěn)定 （ 突變株 ， 使用二倍體或多倍體 ） 分泌能力強(qiáng)
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