基因工程課件2-2章-資料下載頁(yè)
2024-09-20 20:49本頁(yè)面
【正文】 ecA， lacⅠ q， mcrABC， mrr: recA:防止插入 DNA片段內(nèi)的同源重組 ， 以免發(fā)生重排 。 lacⅠ q : 抑制 P1裂解復(fù)制子的激活 , 使 P1質(zhì)粒復(fù)制子在細(xì)胞中以單拷貝形式存在 ， 亦防止外源 DNA分子重排 。 mcr和 mrr: 抑制富含 GpMeC或 ApMeC插入片段的選擇性丟失 3. M13和 fd載體 1) 結(jié)構(gòu)特征 — 環(huán)狀 ssDNA，病毒顆粒呈絲狀 2) 復(fù)制過程 ： ss（ +） RF(01 min) RF RF(020 min) RF ss(+)(20 min→ ∞)DNA包裝無(wú)嚴(yán)格限制 3) 生活史 a. 病毒粒子靠小分子衣殼蛋白和 A蛋白附著于性纖毛頂端（ F因子提供） b. 病毒 DNA和 A 蛋白進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，大部分衣殼蛋白則留在細(xì)胞膜上 c. 病毒 DNA變?yōu)殡p鏈復(fù)制形式（ RF） , 衣殼蛋白可能為 DNA復(fù)制提供附著位點(diǎn) d. RF進(jìn)行滾環(huán)復(fù)制，形成單鏈，同時(shí)基因與蛋白質(zhì)結(jié)合 e. ssDNA環(huán)化，并形成線狀的 DNA— 基因與蛋白質(zhì)復(fù)合物 f. 病毒 DNA穿膜時(shí)，基因與蛋白質(zhì)被附著于膜上的衣殼蛋白取代，完整病毒從細(xì)胞中釋放，釋放時(shí)不殺死細(xì)胞，但因感染細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，仍然可見噬菌斑 M13噬菌體的生活史 1） 基因結(jié)構(gòu) 基因 Ⅰ 、 Ⅳ 和 Ⅶ 編碼特異性蛋白質(zhì)，參與病毒顆粒的組裝 基因 Ⅱ 參與 DNA復(fù)制 基因 Ⅲ 、 Ⅷ 和 Ⅸ 編碼 M13的結(jié)構(gòu)蛋白 基因 Ⅴ 參與單鏈復(fù)制過程中的環(huán)化作用 基因 Ⅵ 是衣殼蛋白的重要組成部分 2） M13mp系列載體 a. 特點(diǎn) ：在 IR區(qū)中插入一個(gè) lacZα基因，然后在該基因中逐漸構(gòu)建一個(gè)多克隆位點(diǎn)區(qū)， dsDNA可用常規(guī)方法直接導(dǎo)入， ssDNA常用感染的方法 噬菌斑的形成用于選擇 DNA導(dǎo)入的細(xì)胞，在 XGal平板上形成的無(wú)色噬菌斑檢測(cè)重組子 b. 優(yōu)點(diǎn) ：易于獲得 ssDNA用于 DNA序列測(cè)定和基因突變，從細(xì)胞中易于檢測(cè)分離到 RF型的 dsDNA用于外源 DNA重組 M13mp系列載體的多克隆位點(diǎn)區(qū) 四 . COS質(zhì)粒載體 1. 結(jié)構(gòu)特點(diǎn) ： 在普通質(zhì)粒載體中插入一個(gè)或兩個(gè)來自 λ的 cos位點(diǎn)片段 , 雙 cos載體比單 cos載體易于重組 l cos位點(diǎn)的精細(xì)結(jié)構(gòu) cos長(zhǎng) 200 bp，由以下幾個(gè)亞單位組成： a. cosN— 由 λ末端酶的 gpA亞基識(shí)別和切割，產(chǎn)生 512 突起； b. cosB— 分別位于 cosN的兩側(cè)，稱之為 cosBL（左側(cè)）和cosBR（右側(cè)），為 蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn) 。 R R2和 R3長(zhǎng) 16 bp，其中有 12個(gè) ，可與gpNul蛋白進(jìn)行體外結(jié)合。 R4與上述三個(gè) R片段僅有 8個(gè) ，不能與 gpNul蛋白進(jìn)行體外結(jié)合，但可以和全酶結(jié)合（ ATP存在時(shí)）。 I1為 IHF結(jié)合位點(diǎn)。 C o s B C o s N R 3 I 1 R 2 R 1 N u 1 + 2 0 0 8 0COS位點(diǎn)的結(jié)構(gòu) 2. 優(yōu)點(diǎn) ⅰ . 容量大（可達(dá) 48 kb），用于基因簇的克隆 ⅱ . 形成的重組 DNA分子可進(jìn)行體外包裝，并能感染 胞（在細(xì)胞內(nèi)不能形成噬菌體顆粒，因而不能形成噬菌斑） ⅲ . 操作簡(jiǎn)便，可直接轉(zhuǎn)化細(xì)胞 ⅳ . 對(duì)重組 DNA分子長(zhǎng)度具有選擇性包裝 ： 與質(zhì)粒載體相同，利用抗生素抗性選擇轉(zhuǎn)化子 例子 : pJB8和 C2XB C 2XB( 6. 6 kb )C O SC O SSm B HCEA m pr C O Sp J B8( 5. 4 kb )PE B ECHSm ACOS質(zhì)粒載體結(jié)構(gòu)圖 五 . 噬粒載體（ phagemid） 1. 結(jié)構(gòu)特點(diǎn) ： 在質(zhì)粒載體中插入一段 M13或 fd的復(fù)制起點(diǎn)，其插入方向決定在噬菌體顆粒中形成正鏈還是負(fù)鏈 2. 優(yōu)點(diǎn) ⅰ .可以質(zhì)粒方式復(fù)制，高拷貝存在于 ，便于大量提取質(zhì)粒 DNA用于 DNA重組 ⅱ .當(dāng)有輔助噬菌體存在時(shí)（如 M13K07和 R408），噬質(zhì)粒重組 DNA分子將以 f1復(fù)制起點(diǎn)開始進(jìn)行復(fù)制，形成單鏈 DNA和噬菌體顆粒，形成的單鏈 DNA可用于定序和特異位點(diǎn)突變 T7AprF 1 o r ipGEM5Zf()( 3 0 0 3 b p )or il a c ZMC SSp 6T7AprF 1 or ipGEM5Zf()( 3 0 0 3 b p )or il a c ZMC SSp 6噬粒載體 pGEM結(jié)構(gòu)
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