基因工程ppt課件-資料下載頁
2024-09-20 18:26本頁面
【正文】 ? DNA連接酶催化雙鏈 DNA一端 3ˊOH與另一雙鏈 DNA的 5ˊ端磷酸根 形成 3ˊ→5ˊ 磷酸二酯鍵，使具有相同粘性末端或平端的 DNA兩端連接起來。 46 限制性內(nèi)切酶識別的靶序列與 DNA的來源無關(guān) ，任何不同來源的 DNA，經(jīng)過適當(dāng)限制酶處理后，都能通過它們的粘性或平齊末端連接起來，這是 DNA重組技術(shù)的基礎(chǔ)。 47 5. 重組 DNA分子的轉(zhuǎn)化 ? 轉(zhuǎn)化 是指將質(zhì)粒或其他外源 DNA導(dǎo)入處于 感受態(tài)的 宿主細胞，并使其獲得新的表型的過程。 ? 轉(zhuǎn)化常用的宿主細胞是 大腸桿菌 。 ? 增殖轉(zhuǎn)化細胞，使得有足夠數(shù)量的轉(zhuǎn)化細胞用于篩選程序。 48 6. 陽性克隆的篩選和檢測 目的基因 載體 限制性內(nèi)切酶 限制性內(nèi)切酶 DNA連接酶 載體自連 目的基因自連 重組體 49 陽性克隆的檢測方法 : ? 抗藥性標(biāo)記選擇 ? 藍白斑篩選 ? 分子雜交法 ? 插入片段大小的鑒定（酶切， PCR） ? 測序 50 許多載體（如 M13系列、 pUC系列、 pGEM系列）載體上帶有大腸桿菌的 β半乳糖苷酶基因 （ lacZ）的 調(diào)控序列和前 146個氨基酸（ LacZ’ ） 的編碼信息。在這個編碼區(qū)中插入了一個多克隆位點（ MCS），它并不破壞讀碼框（ ORF），可使少數(shù)幾個氨基酸插入到 β半乳糖苷酶的氨基端而不影響功能。 藍白斑篩選的原理： （ α互補） 51 乳糖操縱子 ? LacZ基因編碼半乳糖苷酶 ? 分解 Xgal→ Blue product ? LacZ’ 復(fù)習(xí) 52 這種載體適用于可編碼 β半乳糖苷酶 C端部分序列 的宿主細胞 (如 E. coli DH5α )。 因此，宿主和質(zhì)粒編碼的片段雖都沒有酶活性，但它們同時存在時，可形成具有酶學(xué)活性的蛋白質(zhì)。 這樣， lacZ基因在缺少 近操縱基因區(qū)段的宿主細胞與帶有完整近操縱基因區(qū)段的質(zhì)粒之間實現(xiàn)了互補，稱為 α互補 。 53 由 α互補而產(chǎn)生的 LacZ+細菌在誘導(dǎo)劑 IPTG的作用下，在生色底物 XGal存在時產(chǎn)生 藍色菌落 ，因而易于識別。 然而，當(dāng)外源 DNA插入到質(zhì)粒的多克隆位點后，幾乎不可避免地導(dǎo)致無 α互補能力的氨基端片段，使得帶有重組質(zhì)粒的細菌形成 白色菌落 。這種重組子的篩選，又稱為 藍白斑篩選 。 54 55 α互補的檢測 56 57 7. 基因文庫的應(yīng)用 ? 建立和使用基因文庫是 分離基因 ，特別是分離高等真核生物基因的有效手段。 ? 如果一個哺乳動物的基因組是 3 109堿基對，直接從細胞中提取并分離出某一特定基因的 DNA片段在技術(shù)上是很困難的。 但是在基因文庫中，不同的 DNA片段都分別在不同的克隆中擴增了，只要有該基因的探針存在，則從許多克隆中篩選一個所需的克隆是一項比較簡單的工作。 58 基因工程的主要目的之一，就是要制備大量有用的蛋白質(zhì)和多肽，尤其是人體蛋白。 得到了克隆的基因或 cDNA后，按照正確的方向插入 表達載體 ，連在啟動子的后面，導(dǎo)入相應(yīng)的宿主細胞，即可進行表達。在不同的表達系統(tǒng)中，其表達方式不盡相同。 第六節(jié) 克隆基因的表達 59 表達載體
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