【正文】 可引起細胞膜可逆性穿孔的原理 ， 用激光處理細胞 ， 處于細胞周圍的 重組 DNA隨之進入細胞 。 此方法適用于活細胞中線粒體和葉綠體等細胞器的基因轉(zhuǎn)移 。 基因?qū)氲姆椒ǘ喾N多樣 ， 可根據(jù)具體要求進行選擇 ， 具體操作也參考有關(guān)實驗手冊 。 132 德國科學家轉(zhuǎn)基因試驗成功 小豬身上能發(fā)出綠光 2022年 10月 27日 12:15 新華網(wǎng) 新華網(wǎng)柏林 10月 26日電 （ 記者潘治 ） 德國科學家最近利用去除活性的病毒作為載體 將外來基因植入豬胚胎體內(nèi) ， 成功培育出體內(nèi)各組織因表現(xiàn)植入基因特性而發(fā)出綠光的幼豬 。 這一成果被認為對今后有目的地培養(yǎng)供人體所用的移植器官具有重要意義 。 慕尼黑大學科學家亞歷山大 普法伊費爾與埃克哈德 沃爾夫等人在 《 歐洲分子生物學組織通訊 》 上發(fā)表論文說，他們在豬胚胎尚是單細胞階段時就利用沒有毒性的慢病毒作為載體，向其植入了一種名為 GFP的外來基因。這種基因可以編碼生成發(fā)出綠光的蛋白質(zhì)?？茖W家們同時也給豬胚胎植入了一段人體 DNA，該片斷控制著皮膚細胞內(nèi)某特定基因的活性。 133 他們認為，這是朝著有目的地植入基因以改變動物特性及培養(yǎng)適用于人體的移植器官的重要一步?！?通過有目的地植入遺傳物質(zhì)，將來可以培養(yǎng)出適合人類接受、不產(chǎn)生排異反應的移植器官 ”，沃爾夫說。 134 目前重組體篩選的方法很多 ， 概括起來有三類： （ 1） 生物學方法：包括遺傳學方法 、 免疫學方法和噬菌斑的形成等； （ 2） 核酸雜交：通過 DNADNA、 DNARNA堿基配對的原理進行篩選 ， 以探針的使用為核心 ， 包括 原位雜交 、 Southen雜交 、 Northen雜交等 ； （ 3） 物理方法：如用電泳法等 。 第六節(jié) 重組體的鑒定與篩選 135 一、遺傳檢測法 （一）抗性篩選法：如 pUC1 pSK等能否質(zhì)粒載體中都存在有氨芐青霉素的抗性基因，生長；藍色和白色菌落，其中白色菌落可能含重組質(zhì)粒。 （二）插入失活選擇法 在載體上本來有一個正常表達的基因，在這一基因中間有些多科隆位點，在沒有外源DNA插入時該基因可正確表達，當外源 DNA插入到基因這個中間時，該基因就不能正確表達，這種現(xiàn)象稱為插入失活。 136 二、重組質(zhì)粒的快速提取與酶切鑒定 137 三、核酸分子鑒定法 核酸雜交技術(shù) （基于堿基互補配對） Southern雜交 DNA片段 Northern雜交 RNA 原位雜交 138 * 是 southern于 1975年創(chuàng)建用以鑒定 DNA中某一特定的基因片段的技術(shù)，也稱為Southern印跡（ Southern Blot）。 * 通過標記的探針 DNA與靶 DNA結(jié)合，檢測目的基因的存在及大小。 Southern雜交 139 Northern雜交 * 也稱為 Northern印跡（ Northern Blot），用以檢測某一特定的 RNA（通常是 mRNA）片段的存在及表達量。 * 因與 DNA的雜交（ Southern 雜交）相對應，故被趣稱為 Northern雜交。 140 原位雜交 * 細胞或染色體的原位雜交，用于基因定位。 * 細菌菌落的原位雜交：篩選陽性克隆。 141 四、 Western(印跡 )雜交 * 蛋白質(zhì)水平上的雜交技術(shù)，又稱為免疫印跡，即檢測蛋白質(zhì)與標記的特定蛋白抗體結(jié)合，經(jīng)放射自顯影顯示條帶，根據(jù)條帶密度確定蛋白質(zhì)表達量。 * 與 DNA、 RNA水平上的 Southern雜交、Northern雜交相對應，稱為 Western雜交。 * 常結(jié)合 Northern印跡技術(shù)，檢測基因表達調(diào)控。 142 五、序列測定 Sanger等（ 1977）發(fā)明的雙脫氧鏈末端終止法。 143 第七節(jié) 轉(zhuǎn)基因技術(shù) （ Transgenic technology） 144 轉(zhuǎn)基因與轉(zhuǎn)基因動物速生長效應的“轉(zhuǎn)基因超級鼠”。轉(zhuǎn)基因鼠比與它同胎所生的小鼠生長速度快 2～ 3倍，體積大一倍。 轉(zhuǎn)基因超級鼠 1982年，英國的 《 自然 》 雜志發(fā)表了一篇文章：有兩個美國實驗小組利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將大鼠 生長激素重組基因?qū)氲叫∈笫芫阎?,培育出具快速生長效應的“轉(zhuǎn)基因超級鼠”。轉(zhuǎn)基因鼠比與它同胎所生的小鼠生長速度快 2～3倍，體積大一倍。 145 轉(zhuǎn)基因： 1）將人工分離和修飾過的基因?qū)氲缴矬w基因組中，由于導入基因的表達，引起生物體的性狀的可遺傳的修飾，稱之為轉(zhuǎn)基因技術(shù)。 2）轉(zhuǎn)基因技術(shù)就是指利用分子生物學技術(shù)，將某些生物的基因轉(zhuǎn)移到其它物種中，改造生物的遺傳物質(zhì)，使遺傳物質(zhì)得到改造的生物在性狀、營養(yǎng)和消費品質(zhì)等方面向人類需要的目標轉(zhuǎn)變。 轉(zhuǎn)基因動物： 所謂轉(zhuǎn)基因動物就是指以實驗方法將外源基因?qū)雱游锶旧w基因組內(nèi)穩(wěn)定整合并能遺傳給后代的一類動物。 一、概念 146 顯微注射法： 將 DNA注射到胚胎的細胞核內(nèi)，再把注射過 DNA的胚胎移植到動物體內(nèi)，使之發(fā)育成正常的幼仔。 體細胞核移植方法： 先在體外培養(yǎng)的體細胞中進行基因?qū)氩⒑Y選。然后將帶轉(zhuǎn)基因體細胞移植到去掉細胞核的卵細胞中，生產(chǎn)重構(gòu)胚胎。 轉(zhuǎn)基因的方法 147 Microinjection of DNA in to the nucleus of a recently fertilized egg. The egg is held in place by a suction pipette shown at the bottom, while the injection pipette is shown perating the egg at the top. Transgenic mice. This photograph shows a pair of littermates at age 10 weeks. The larger mouse developed from an egg that had been injected with DNA containing the rat growth hormone gene placed downstream from a metal lothioein promoter. The larger mouse weights 44g。 the smaller, uninjected control weighs 29g. 148 3．逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法： 最早用來得到轉(zhuǎn)基因小鼠的方法，利用逆轉(zhuǎn)錄載體將遺傳信息以 RNA分子的形式，在逆轉(zhuǎn)錄整合酶和逆轉(zhuǎn)錄基因組末端的特異性核酸序列的作用下，反轉(zhuǎn)錄并整合到宿主基因組中去，最終得到轉(zhuǎn)基因小鼠。 4．胚胎干細胞法： 將轉(zhuǎn)染的胚胎干細胞注射入受體囊胚腔，可參與嵌合體的形成，將來出生的動物的生殖系統(tǒng)就有可能整合上外源基因，通過雜交繁育得到純合目的基因的個體，即為轉(zhuǎn)基因動物。 149 研究基因的結(jié)構(gòu)與功能，了解動物生命現(xiàn)象的內(nèi)在本質(zhì)。 建立多種疾病的動物模型，研究發(fā)病機理及治療方法。 改善動物生產(chǎn)性能，提高動物育種效率。 作為醫(yī)用或食用蛋白的生物反應器?？梢酝ㄟ^家畜乳腺分泌大量安全、高效、廉價的人體藥用蛋白。 轉(zhuǎn)基因動物的應用前景 150 生物反應器是指利用轉(zhuǎn)基因活體動物的某種能夠高效表達外源蛋白的器官或組織來進行工業(yè)化生產(chǎn)活性功能蛋白的技術(shù)，這些蛋白一般是藥用蛋白或營養(yǎng)保健蛋白。 什么是生物反應器？ 151 生物反應器的種類及應用 用于表達的生物反應器包括動物血液、泌尿系統(tǒng)、精囊腺、乳腺等，還包括禽蛋和昆蟲（例如家蠶）個體等。 其中動物乳腺生物反應器是目前國際上唯一證明可以達到商業(yè)化生產(chǎn)水平的生物反應器。據(jù)預測， 2022年世界上動物乳腺生物反應器的年產(chǎn)值將達到 500億美元以上。 152 四個轉(zhuǎn)基因作物種植大國 2022年數(shù)據(jù) 四個主要國家轉(zhuǎn)基因作物種植面積占全球９９％。 美國占６６％，達３９００萬公頃，轉(zhuǎn)基因作物產(chǎn)量也居世界第一，美國種植的７５％的大豆、３４％的棉花和７１％的玉米都是轉(zhuǎn)基因作物。 阿根廷占２３％，達１３５０萬公頃。 加拿大占６％，達３５０萬公頃。 中國第四位，占４％，達２１０萬公頃。 歐盟國家總面積不到２０萬公頃，０ .３％左右。 153 食品安全問題： 1）未知的可能副作用？ 2）外源基因在人體內(nèi)表達？ 技術(shù)問題： 1）成本； 2）成功率； 3）基因組的有效整合、穩(wěn)定遺傳； 存在問題 154 第五節(jié) 動物克隆技術(shù) (Animal Cloning Technology) 155 Creating Dolly！ 1997年 2月 22日，英國“ Nature”刊登了愛丁堡羅斯林研究所維爾穆特的研究成果，即“多莉”羊的克隆成功，從此震驚了世界。 156 多莉的生命歷程 1998年 4月與威爾士山羊戴維產(chǎn)下邦尼，證明了克隆動物也能生育。 ：多莉因早衰并患有肺炎，被迫實施了安樂死。 由于早衰問題，人們 懷疑“多莉是穿著羔羊服裝的老羊” 。 157 羅斯林研究所科學家取一頭普通白綿羊的乳腺細胞，將細胞核移植到一個剔除了細胞核的卵子中，使之融合、分裂、發(fā)育成胚胎，然后移植到第三頭羊的體內(nèi)?？茖W家共培育 277個胚胎，只有多莉成功出生。 1996年 7月 5日，多莉降臨人世。直到 1997年 2月 23日才公布于眾。 158 細胞核移植得到的個體都叫做 克隆 。 核移植是指利用顯微外科手術(shù)的方法將胚胎細胞或成體細胞的細胞核移人去核的卵母細胞中，構(gòu)建成重組胚，通過體內(nèi)或體外培養(yǎng)、胚胎移植，產(chǎn)生與供體細胞基因型相同的后代的技術(shù)過程，又稱為動物克隆技術(shù)。根據(jù)核供體的來源不同，可將其分為胚胎細胞克隆動物和體細胞克隆動物技術(shù)。 通常所說的動物克隆指 體細胞克隆 ，即動物的無性繁殖。 什么叫克??？ 159 克隆動物的一般步驟 ?體細胞的采集和培養(yǎng) ?采集卵細胞并去除卵細胞的細胞核 ?取出體細胞的細胞核 ?用微注射法注入去除核的卵細胞中去 ?將重組胚細胞在體外進行適當培養(yǎng) ?將轉(zhuǎn)核胚置入同期母體子宮，完成發(fā)育 160 動物克隆的意義 體細胞與胚胎干細胞的相互轉(zhuǎn)化 體細胞 胚胎干細胞 161 對傳統(tǒng)動物繁殖模式的挑戰(zhàn)； （ AI、 Clone） 對社會倫理的挑戰(zhàn)；延續(xù)生命。 保存物種多樣性和瀕臨滅絕的動物 生產(chǎn)醫(yī)用器官、動物生物反應器 轉(zhuǎn)基因與動物克隆技術(shù)相結(jié)合，可降低生產(chǎn)成本。 162 第九節(jié) 基因診斷 基因治療 (gene therapy) 是指將人的正?；蚧蛴兄委熥饔玫幕蛲ㄟ^一定方式導入人體靶細胞以糾正基因的缺陷或者發(fā)揮治療作用（也包括剔除或抑制某些導致疾病的基因），從而達到治療疾病目的的生物醫(yī)學新技術(shù)。 基因疫苗 指的是 DNA疫苗，即將編碼外源性抗原的基因插入載體，然后導入人或動物體內(nèi)，讓其在宿主細胞中表達抗原蛋白，誘導機體產(chǎn)生免疫應答。 163 傳統(tǒng)的基因治療指目的基因?qū)氚屑毎笈c宿主細胞的基因組發(fā)生整合，成為宿主細胞遺傳物質(zhì)的一部分，目的基因的表達產(chǎn)物起到對疾病的治療作用。 目的基因不與宿主細胞基因組發(fā)生整合，暫時表達產(chǎn)物發(fā)揮治療作用的基因治療方法叫做基因療法 (gene therapeutics)。 廣義的基因治療還應包括基因調(diào)控，如利用RNAi技術(shù)抑制基因表達。 164 一、基因診斷的基本方法 ?DNA 分子雜交 ?限制性內(nèi)切酶酶譜分析 ?限制性片段長度多態(tài)性的連鎖分析 ?PCR方法 ?寡核苷酸探針法 165 （二）基因芯片 基因芯片簡介 基因芯片的種類 ?診斷芯片 ?檢測芯片 ?表達譜基因芯片 3基因芯片的應用 166 生物芯片 1 167 生物芯片