【正文】 1 第十一章 動(dòng)物基因工程 2 第一節(jié) 基因工程概述 理論上的三大發(fā)現(xiàn) ?DNA為遺傳物質(zhì)： Avery的肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn) ?DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的發(fā)現(xiàn)和 DNA半保留復(fù)制機(jī)制 ?遺傳密碼與中心法則 3 技術(shù)上的三大發(fā)明 ： DNA的“手術(shù)刀”與“縫紉機(jī)” ：運(yùn)送遺傳物質(zhì)的工具，如質(zhì)粒、病毒等 ：從 mRNA到 DNA，使真核基因制備成為可能 4 5 6 7 8 9 10 11 12 基因工程的內(nèi)容 ?目的基因的獲得 ?目的基因與載體的連接成重組DNA分子 ?重組 DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞 ?篩選重組克隆 ?基因表達(dá)與產(chǎn)物分離 13 基因操作中的工具酶 手術(shù)刀 －限制性核酸內(nèi)切酶、核酸外切酶 縫紉機(jī) －連接酶 復(fù)印機(jī) － DNA聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶 第二節(jié) 基因操作中的工具酶 14 一、限制性內(nèi)切酶的概述 （一） 概念 限制性核酸內(nèi)切酶簡稱限制性內(nèi)切酶，是一類能識(shí)別雙鏈 DNA中特定核苷酸序列并具有專一切割位點(diǎn)的脫氧核糖核酸水解酶。 主要存在于細(xì)菌、霉菌中，至今已分離到 1000種以上，搞清識(shí)別序列的有 300種以上。 15 （二）限制性內(nèi)切酶 命名規(guī)則 限制酶的命名從其來源微生物的拉丁名中摘取，即由其屬名的第一個(gè)字母 (大寫 )與種名的第一、二兩個(gè)字母 (小寫 )組成酶的基本命名，若酶的產(chǎn)生菌由株系之分，則有 4個(gè)或 4個(gè)以上拉丁字母組成，其第四個(gè)字母之后表示株系。 如 EcoRI來源于 RY13 BamHI來源于 16 H in d II Haemophilus(屬名 ) Influenzae(種名 ) d(株系 ) 羅馬數(shù)字 限制性內(nèi)切酶命名舉例 17 類別 反應(yīng)必須因子 專一性 活性 I型 S腺苷基蛋氨酸，ATP， Mg2+ 識(shí)別部位和切點(diǎn)不同， 無特定切割位點(diǎn) 內(nèi)切 甲基化 II型 Mg2+ 切斷識(shí)別部位或其附近的特定部位 只有限制酶活性 III型 ATP， Mg2+ 識(shí)別部位和切點(diǎn)不同，但切斷特定部位 內(nèi)切 甲基化 （三）限制性內(nèi)切酶分類 18 19 （四） II 型限制性內(nèi)切酶的特性 （ 1） II型限制酶的識(shí)別特異性 ? 回文識(shí)別序列 II型限制酶的識(shí)別序列大多是具有 雙重對稱結(jié)構(gòu)性結(jié)構(gòu) ,或稱 回文序列 (Palindromic Sequence) 20 （ 2） 識(shí)別特定的核苷酸序列 ， 其長度一般為 4－ 8個(gè)核苷酸且呈二重對稱 。 （ 3） 具有特定的酶切位點(diǎn) ， 即限制性內(nèi)切酶在其識(shí)別序列的特定位點(diǎn)對雙鏈 DNA進(jìn)行切割 ， 由此產(chǎn)生特定的酶切末端 。 21 識(shí)別序列 (位點(diǎn) ) ?雙鏈 DNA分子上能識(shí)別的特定核苷酸序列 ?被識(shí)別的堿基序列通常具有雙軸對稱性，即回文序列(Palindromic Sequence)。 的識(shí)別序列 22 二、 DNA聚合酶 （ 一） DNA聚合酶 (DNA Polymerase)的基本特性 能夠?qū)⒚撗鹾颂呛塑账徇B續(xù)地加到雙鏈 分子引物鏈的 末端催化核苷酸的聚合作用，而不發(fā)生引物從膜版上的解離作用。 ＋ ， ， ， ， ＋ 聚合酶 23 大腸桿菌 DNA 聚合酶 Ⅰ 1． DNA 聚合酶 Ⅰ 的活性 ① 5‘3’ DNA 聚合酶活性。 ② 5‘3’ 外切核酸酶活性。 ③ 339。539。 外切酶活性。 24 2． DNA 聚合酶 Ⅰ 的用途 ① 利用 DNA 聚合酶 Ⅰ 的 5‘3’ 外切核酸酶活性，可用切口平移法（ nick translation ）標(biāo)記 DNA ，所有 DNA 聚合酶中只有此酶有此反應(yīng)。 ② 用于 cDNA 克隆中的第二鏈，即單純的 DNA 聚合活性。但由于具有 5‘3’ 外切活性，現(xiàn)在已不再使用，而改用 Klenow 酶和反轉(zhuǎn)錄酶（詳見后面）。 ③ 對 3‘ 突出端的 DNA 作末端標(biāo)記（交換或置換反應(yīng)），但是此反應(yīng)用 T4 或 T7 DNA 聚合酶效果會(huì)更好 。 25 （二） Klenow DNA 聚合酶 ?無 5’→ 3’外切活性 ?有聚合活性 ?有 3’→ 5’外切活性 ?由于沒有 539。339。外切活性，使用范圍進(jìn)一步擴(kuò)大 26 Klenow DNA 聚合酶用途 ① 補(bǔ)平 3’ 凹端 DNA 。 ② 抹平 DNA 3’凸端。 ③ 通過置換反應(yīng)對 DNA 進(jìn)行末端標(biāo)記。 ④ 在 cDNA 克隆中合成第二鏈。 ⑤ 隨機(jī)引物標(biāo)記。 ⑥ 應(yīng)用于 Sanger 雙脫氧鏈末端終止法的 DNA 測序。 ⑦ 應(yīng)用于 PCR 反應(yīng)，現(xiàn)在已經(jīng)被 Taq DNA 聚合酶等取代。 ⑧ 在體外誘變中，用于從單鏈模板合成雙鏈 DNA 。 27 （三） T4 噬菌體 DNA 聚合酶 T4 噬菌體 DNA 聚合酶來源于 T4 噬菌體感染的 ，分子量 114kDa 。 T4 噬菌體 DNA 聚合酶與 Klenow 酶相似，但 3‘5’ 外切活性強(qiáng) 200 倍，且不從單鏈 DNA 模板上替換引物，因此在誘變反應(yīng)中更有用，誘變率約提高 1 倍。 28 （五）逆轉(zhuǎn)錄酶 逆轉(zhuǎn)錄酶是一種有效地轉(zhuǎn)錄 RNA產(chǎn)生 cDNA的酶 。產(chǎn)物 DNA 稱 cDNA ， 即 互 補(bǔ) DNA (plementary DNA)， 該酶又稱為依賴于RNA的 DNA聚合酶 (RNAdependent DNA polymerase)。 逆轉(zhuǎn)錄酶在基因工程中的主要用途是以真核mRNA為模板 ， 合成 cDNA， 用以組建 cDNA文庫 ， 進(jìn)而分離為特定蛋白質(zhì)編碼的基因 。 29 （六）末端轉(zhuǎn)移酶 ?來源于小牛胸腺 ?催化 dNTP 加于 DNA 分子的 3‘ 羥基端 ?dNTP 為 T 或 C ，二價(jià)陽離子首選 CO 2+；為 A 或 G 首選 Mg 2+ ?對 3‘ 羥基突出末端的底物作用效率最高 ?在 cDNA 或載體 3‘ 末端加同聚尾用于克隆 ?用標(biāo)記的 rNTP、 dNTP 或 ddNTP 來標(biāo)記 DNA 片段的 339。 末端。 30 DNA聚合酶在基因工程中的用途： 1) DNA分子的體外合成 2) 體外突變 3) DNA片段探針的標(biāo)記 4) DNA的序列分析 5) DNA分子的修復(fù) 6) 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (PCR)等 31 三、 DNA連接酶與 DNA分子的體外連接 體外 DNA片段的連接方式： （ 1） 用 DNA連接酶連接具有互補(bǔ)粘性末端的 DNA片段 （ 2） 用 T4DNA連接酶將平端的 DNA片段連接起來 （ 3） 先在 DNA片段的末端加上化學(xué)合成的銜接物或接頭 ， 使之形成粘性末端之后 ， 再用 DNA連接酶將它們連接起來 。 注意： DNA連接酶 不能連接兩條單鏈的 DNA分子或環(huán)化單鏈的 DNA分子 ， 被連接的 DNA鏈必須是雙螺旋DNA分子的一部分 。 用于將兩段乃至數(shù)段 DNA片段拼接起來的酶稱為連接酶 。 它催化 DNA 5’－磷酸基與 3’－羥基之間形成磷酸二酯鍵 。 32 具有 3’OH和 5’P基團(tuán)的缺口 被 DNA連接酶封閉起來 如果缺失一個(gè)或數(shù)個(gè)核苷酸的裂口 DNA連接酶則不能將它封閉起來 注意： 連接酶 如果缺失一個(gè)或數(shù)個(gè)核苷酸的裂口 DNA連接酶則不能將它封閉起來 33 四、 其他酶類 、 多核苷酸酶 T4 多核苷酸酶催化 ATP的 ?磷酸基轉(zhuǎn)移至 DNA或RNA片段的 5‘未端 。 在基因工程中主要用于： 1) 標(biāo)記 DNA片段的 5’ 端 ， 制備雜交探針 ， 2) 基因化學(xué)合成中 ， 寡核苷酸片段 5‘ 磷酸化 ， 3) 用于測序引物的 5‘ 磷酸標(biāo)記 。 34 堿性磷酸酶 堿性磷酸酶的功能是去除 或 5＇ 未端的磷酸基 ， 反應(yīng)可表示為： 堿性磷酸酶 5‘p DNA或 5’p RNA 5’－ HO DNA或 5’－ OH RNA 堿性磷酸酶可用于： 1)去除 片段 5‘磷酸 ， 以防止在重組中的自身環(huán)化 ， 以提高重組效率 。 2)在用 ［ r32P］ ATP標(biāo)記 或 RNA的 5’磷酸前 ， 去除 或片段的非標(biāo)記 5’磷酸 。 35 利用堿性磷酸酶 CIP 防止 載體的再環(huán)化 pUC19 SacI KpnI SmaI BamHI XbaI SalI PslI SphI Hind III 對接 DNA 可通過凝膠電泳純化靶 DNA 3’OH 3’OH 5”P 5”P 5”P 5”P 3’OH 3’OH 用 T4噬菌體DNA連接酶連接去磷酸化的質(zhì)粒與靶 DNA 3’OH 3’OH 3’OH 3’OH 用 CIP去除 5‘P 限制性內(nèi)切酶 3’OH 3’OH 3’OH 3’OH 鑒定重組子： 檢查 a互補(bǔ)能力的喪失情況 核酸雜交 對小量制備的質(zhì)粒 DNA進(jìn)行酶切分析 CIP：牛小腸提取 BAP: 大腸桿菌提取 36 核酸酶 （ nuclease） 核酸外切酶：可降解 dsDNA中或 DNARNA中的一條鏈 核酸內(nèi)切酶：可切割 DNA鏈中的單鏈 （ 1） BAL31 核酸酶（ BAL31 nuclease）：來源于交替單胞菌 ，主要活性為 339。 外切核酸酶活性，可從線性 DNA 兩條鏈的 339。 端迅速去除單核苷酸，隨后可從單鏈 DNA 內(nèi)部發(fā)揮緩慢的內(nèi)切酶活性，形成截短了的平端雙鏈 DNA 分子（約占 1020%）以及帶有約 5 個(gè)核苷酸突出單鏈的截短分子（約占 8090%）。對于所形成的單鏈突出，可用 DNA 聚合酶補(bǔ)平。 37 （ 2） Sl 核酸酶（ S1 nuclease） Sl 核酸酶來源于米曲霉，可降解單鏈 DNA 或 RNA ，是一種單鏈核酸酶。產(chǎn)生帶 539。 磷酸的單核苷酸或寡核苷酸雙鏈，對 dsDNA、 dsRNA 和 DNA:RNA 雜交體不敏感。酶濃度大時(shí)可完全消化雙鏈，中等濃度可在切口或小缺口處切割雙鏈。 該酶可用于分析 DNA:RNA 雜交體的結(jié)構(gòu)，去掉雙鏈核酸中突出的單鏈尾從而產(chǎn)生平末端，打開雙鏈 cDNA 合成中產(chǎn)生的發(fā)莢環(huán)。 38 （ 3）脫氧核糖核酸酶 Ⅰ （ DNase Ⅰ ） DNase Ⅰ 來源于牛胰，是內(nèi)切核酸酶，可優(yōu)先從嘧啶核苷酸的位置水解雙鏈或單鏈 DNA 。在 Mg 2+ 存在下，獨(dú)立作用于每條 DNA 鏈，且切割位點(diǎn)隨機(jī)。在 Mn 2+ 存在下，它可在兩條鏈的大致同一位置切割 dsDNA ，產(chǎn)生平端或 12 個(gè)核苷酸突出的 DNA 片段。 39 （ 4）核糖核酸酶 A （ Ribonuclease A 或 RNase A） 核糖核酸酶 A 來源于牛胰，為內(nèi)切核酸酶，可特異攻擊 RNA 上嘧啶殘基的 3‘ 端。可除去 DNA:RNA 中未雜交的 RNA 區(qū)，可用來確定 DNA 或 RNA 中單堿基突變的位置。廣泛用來去除 DNA 樣品