【正文】 第四章 哺乳動物基因工程 一、哺乳動物基因轉(zhuǎn)移的遺傳選擇標(biāo)記 迄今為止 ， 已知的絕大多數(shù)的哺乳動物病毒載體 ， 除了牛乳頭病毒載體外 ， 都得附加上標(biāo)記基因 ， 才能進(jìn)行有效的選擇 。 常用的這些標(biāo)記基因有：胸苷激酶基因 (tk)、二氫葉酸還原酶基因 (dhfr)、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因 (cat)、細(xì)菌的黃嘌呤 鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶基因 (Ecogpt)以及細(xì)菌的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因 (Econeo）等。 哺乳動物基因轉(zhuǎn)染實驗常用的顯性選擇標(biāo)記 1． 嘌呤和嘧啶的生物合成 （ 1）嘌呤的生物合成 APRT：腺嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶； HGPRT：次黃嘌呤 鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶； XGPRT：黃嘌呤 鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶。 （ 2）嘧啶的生物合成 胸苷激酶基因選擇系統(tǒng) (1) TK細(xì)胞 胸苷激酶 (thymidin kinase， TK)是核苷酸合成代謝途徑中的一種酶 ， 能夠把胸苷轉(zhuǎn)換為胸苷一磷酸 。 在單純皰疹病毒 (HSV)中發(fā)現(xiàn)的胸苷激酶的編碼基因 (tk)， 幾乎在所有的真核細(xì)胞中都能有效地表達(dá) 。 正是由于這種緣故 ， 以確定哺乳動物基因轉(zhuǎn)移可能性為目標(biāo)的大多數(shù)早期實驗 ， 都是采用這個基因作為遺傳選擇標(biāo)記 。 在胸苷激酶基因選擇系統(tǒng)中，首先得建立具 TK表型的細(xì)胞株。這可以通過誘變加選擇的程序獲得。 具體的做法： 把細(xì)胞培養(yǎng)在補加有一種胸苷類似物5溴尿嘧啶脫氧核苷 (BUdR)的培養(yǎng)基中，在胸苷激酶的催化下， BUdR便摻入到細(xì)胞的 DNA分子上，致使 DNA復(fù)制出現(xiàn)錯誤。具有 BUdRDNA的細(xì)胞對UV特別敏感，被迅速地殺死，而少數(shù)突變的 TK細(xì)胞便能夠存活下來。應(yīng)用這種方法已經(jīng)分離到許多種培養(yǎng)細(xì)胞的 TK突變體。 目前最常用的一種 TK 細(xì)胞是小鼠 L細(xì)胞的 TK突變株 。 這種突變株的優(yōu)點是產(chǎn)生回復(fù)突變的頻率相當(dāng)?shù)?， 而且容易被外源 DNA所轉(zhuǎn)化 ， 所以使用起來很方便 ， 即便在不使用 tk基因作選擇標(biāo)記的情況下 ，也可用作受體細(xì)胞 。 (2) HAT選擇法 由于選擇 TK+細(xì)胞的培養(yǎng)基含有次黃嘌呤 (hypoxanthine)、 氨基蝶呤(aminopterin)和胸苷 (thymidine)，所以叫做 HAT選擇法 。 基本原理： 如果用葉酸的類似物氨基蝶呤(APT)處理細(xì)胞 ， 二氫葉酸還原酶便被抑制 ，培養(yǎng)基中的還原輔助因子四氫葉酸因得不到補充而逐漸耗盡 ， 于是從 dUMP合成 dTTP，以及 dATP和 dGTP的重新合成便因此被阻斷 。但次黃嘌呤是 dATP和 dGTP補救合成途徑的一種底物 ， 培養(yǎng)基中補加有此種物質(zhì)時 ， 細(xì)胞能逾越氨基蝶呤的抑制作用 ， 繼續(xù)合成出這些脫氧嘌呤三磷酸 (dATP和 dGTP)。 由于在 HAT培養(yǎng)基中補加有外源的胸苷 ，所以 TK+細(xì)胞通過胸苷激酶的作用可把它合成為 dTTP， 繼續(xù)存活下去；而 TK細(xì)胞則不會發(fā)生這種合成 ， 因而死亡 。 把正常的 tk基因?qū)?TK細(xì)胞 ， 它們也就照樣能夠存活下去 。 所以使用 HAT培養(yǎng)基 ， 能夠選擇出由 tk基因轉(zhuǎn)化而來的 TK+細(xì)胞 。 (3) 共轉(zhuǎn)化選擇 1) 共轉(zhuǎn)化選擇的基本過程 HAT選擇法可以用來分離以 tk基因作選擇標(biāo)記的外源 DNA轉(zhuǎn)化的受體細(xì)胞 。 在磷酸鈣沉淀中 ， 兩種 DNA分子的混合物 ， 能夠同時轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞 。 根據(jù)這種共轉(zhuǎn)化現(xiàn)象 ， 結(jié)合磷酸鈣共沉淀技術(shù) ，人們可以將無選擇標(biāo)記的 DNA同具 tk選擇標(biāo)記基因的 DNA進(jìn)行混合轉(zhuǎn)化 ， 發(fā)展出了共轉(zhuǎn)化選擇體系 ， 從而 解決了不具tk選擇標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)化子的選擇問題 。 3． 二氫葉酸還原酶基因選擇系統(tǒng) (1) 基本原理 二氫葉酸還原酶 (dihydrofolate reductase，DHFR)在真核細(xì)胞的核苷酸生物合成中起著重要的作用 ， 它催化二氫葉酸 (DHF)還原成四氫葉酸(THF)。 這個反應(yīng)過程受到葉酸的類似物氨基蝶呤 (aminopterin， APT)和氨甲蝶呤 (methotrexate，MTX)的競爭性抑制 。 如果細(xì)胞的培養(yǎng)基中含有這些抑制物 ，例如氨甲蝶呤 ， 其濃度只要達(dá) ／ ml，就會阻斷核苷酸生物合成 ， 最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡 。 （ 2）常用的基因 : 1) 小鼠 3T6成纖維細(xì)胞的突變系 3T6— 400來源的突變 dhfr基因。由它合成的突變二氫葉酸還原酶與正常酶相比，同 MTX的結(jié)合能力下降了 270倍。因此，用突變細(xì)胞呈抗性反應(yīng)的 MTX濃度，就可以把野生型細(xì)胞殺死，達(dá)到了顯性選擇的目的。如果把突變基因 dhfrMTX導(dǎo)入正常的細(xì)胞，轉(zhuǎn)化子也就獲得了抗性。 2) 另一個 dhfr顯性選擇標(biāo)記是位于細(xì)菌抗藥性因子 R388上的 dhfr基因。它編碼的二氫葉酸還原酶，實際上就可以抗MTX的抑制作用。 4． 氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因選擇系統(tǒng) 氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶 (chloramphenicol acetyl transferase， CAT)是由大腸桿菌 Tn9轉(zhuǎn)座子上的 cat基因編碼的 ， 它能夠催化乙酰基團(tuán)從乙酰輔酶 A轉(zhuǎn)移到氯霉素分子上 ， 導(dǎo)致一個或兩個羥基發(fā)生乙?；饔?， 從而使其失去活性 。 這個基因可以作為檢測外源基因?qū)胝婧思?xì)胞的一種十分敏感的標(biāo)記基因 ， 尤其是適用于瞬時表達(dá)的研究 。 5． 氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶基因選擇系統(tǒng) 氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶 (APH) 基因也經(jīng)常用 Econeo表示 ， 它是氨基糖苷類抗菌素的抗性基因 ，所編碼的 APH酶可以使此類抗菌素 ， 如 G418失去活性 。 氨基糖苷抗菌素 G418， 即 3’脫氧鏈霉胺 (3’deoxystreptamine)， 在結(jié)構(gòu)上同卡那霉素 、 新霉素及慶大霉素十分相似 。 它通過抑制 70S核糖體的功能而阻斷真核細(xì)胞中的蛋白質(zhì)合成 ， 造成細(xì)胞死亡 。 因此 ， 為我們提供了一種不需要特殊突變細(xì)胞的顯性選擇系統(tǒng) 。 二 、 外源 DNA導(dǎo)入哺乳動物細(xì)胞的方法 1． 磷酸鈣轉(zhuǎn)染技術(shù) (1) 磷酸鈣轉(zhuǎn)染的基本步驟 通過磷酸鈣 DNA共沉淀 ， 將外源基因?qū)氩溉閯游锛?xì)胞的技術(shù)程序 ， 最初是由 Graham等人于 1973年創(chuàng)立的 。 應(yīng)用這種方法 ， 能夠?qū)⑷魏蔚耐庠?DNA有效地導(dǎo)入培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞 ，目前仍被許多實驗室廣泛地使用 。 磷酸鈣轉(zhuǎn)染法的基本操作過程包括： ① 將待轉(zhuǎn)染的外源 DNA同 CaCl2混合制成CaCl2— DNA溶液； ② 在不斷攪拌過程中 ， 逐滴緩慢地加入到Hepes— 磷酸鈣溶液中去 ， 形成一種磷酸鈣DNA共沉淀； ③ 然后用吸管仔細(xì)轉(zhuǎn)移共沉淀物 ， 使之粘附到培養(yǎng)的哺乳動物單層細(xì)胞表面 ， 就會迅速地被細(xì)胞所捕獲 。 保溫幾小時后 ， 將細(xì)胞洗凈 ， 并更換新鮮的培養(yǎng)液 ， 繼續(xù)培養(yǎng)至最終實現(xiàn)外源 DNA的高水平表達(dá) 。 依培養(yǎng)細(xì)胞的不同類型而異 ， 平均每個培養(yǎng)皿中約有 10％ 的細(xì)胞捕獲了外源轉(zhuǎn)染DNA。 據(jù)報道 ， 添加甘油或 DMSO(二甲基亞砜 )會增加某些類型細(xì)胞吸收外源 DNA的數(shù)量 。 (2)影響磷酸鈣轉(zhuǎn)染效率的因素 * DNA— 磷酸鈣共沉淀