【正文】 這種類型的腺病毒載體有可能得到進一步的發(fā)展 。 現在通常是用能表達 El功能的人細胞系 (293細胞 )提供這種輔助功能的 。 因此 ， 可以利用靠近 5’末端的 El早期基因區(qū)克隆外源基因 。例如，失去 XbaI限制位點的 Ad5 DNA的變異體，是先用 XbaI切割腺病毒 DNA，然后把消化片段重新連接起來之后獲得的。 這首先是因為它的基因組 DNA分子量大 ，可插入較大的外源 DNA片段 ， 而且還可以在寄主細胞中大量地增殖 。 利用乳頭瘤病毒基因組這種非整合的特性 ， 克隆在它上面的外源基因的復制與表達 ， 則可免受染色體的控制 ， 而得到大量的擴增 ， 同時又不會導致寄主細胞的裂解死亡 。 可見 ， 此類病毒與人類的關系十分密切 。 在 DNA重組技術發(fā)展之后不久 ， 就有人將外源 DNA片段插入到痘苗病毒的基因組中 ， 得到了具有生物活性的重組病毒 。 第四 ， 反轉錄病毒不但感染效率高 ， 而且通常還不會招致寄主細胞的死亡 ， 被它感染的或轉化的動物細胞能夠持續(xù)許多世代 ， 保持正常生長和形成感染性病毒顆粒的能力 。 當兩種不同的反轉錄病毒在同一寄主細胞中生長時，就會出現一種 DNA被另一種外殼蛋白質包裝成假型病毒的奇特現象。根據在電子顯微鏡下觀察的病毒顆粒的形態(tài)學特征的差異，致癌病毒類群又可區(qū)分成 A、 B、 C、 D四個類型。 RSV病毒感染了雞之后，就會誘發(fā)產生腫瘤。除此之外，在其病毒顆粒內部還包含有 tRNA引物分子、反轉錄酶、 RNaseH和整合酶等組分。 (2)微型病毒復制子 質粒載體 pTBC1就是一種典型的 SV40微型病毒復制子 質粒載體，如果將這種載體導入 COS或 HFS細胞，它們就能利用細胞提供的 T抗原復制出非常大量的拷貝數。 像 pAT153及其它一些 pBR322質粒派生載體都已失去了這段毒性序列 。 ※ 使用 SV40病毒的早期區(qū)段 ， 同樣也可以構建出感染猿猴細胞的病毒 — 質粒載體 。 * 例如，病毒 — 質粒載體 p?C10就是一種典型的穿梭載體，其中的早期區(qū)段和復制起點來自多瘤病毒，質粒是大腸桿菌的 pBR322，克隆的外源DNA是小鼠免疫球蛋白重鏈基因。 (2) 早期區(qū)段取代載體 (i)早期區(qū)段取代載體 3．重組的病毒 — 質粒載體 (1) 含有完整早期區(qū)段和復制起點的病毒 質粒載體 SV40和多瘤病毒 (Polyoma virus)的基因組能夠在寄主細胞中快速地復制 ， 并達到相當高的拷貝數 。最常用的輔助病毒是 tsA突變體 ， 它合成一種溫度敏感的 T抗原 。 而且 ， SV40還存在著寄主細胞的局限性 ， 它只能在受體細胞中增殖 ， 并最終導致寄主細胞的死亡 ， 這樣就不能作長期的培養(yǎng)使用 。 2種早期 mRNA分別編碼大 T抗原和小 t抗原 (即腫瘤蛋白質或抗原 )。 例如，現在已經弄清緊挨這個起點的 DNA序列，是調節(jié)早期和晚期初級轉錄本合成的控制信號。 感染之后的 SV40基因組 ， 輸送到細胞核內進行轉錄和復制 。 如 ， 人體細胞 。 ① 受體細胞： SV40感染細胞之后 ， 產生感染性的病毒顆粒 ， 并使寄主細胞裂解 。 其主要原因在于： * 目前有關該病毒的分子生物學知識已有了相當明顯的進步。 ④ 有些動物病毒，在它們的復制過程中能高效穩(wěn)定地整合到寄主核基因組上。 ② 有許多種動物病毒 ， 在其感染周期中都能夠持續(xù)地復制 ， 使其基因組拷貝數達到相當高的水平 。 三、轉化載體 （一） SV40病毒載體 在動物基因工程的研究領域中 ， 關于病毒載體方面的工作 ， 占據著相當重要的地位 。這個過程叫做胚胎干細胞轉移 (embryonic stem cell transfer)。 第二步： 將此載體經適當限制酶消化作用而被線性化之后 ， 轉染給培養(yǎng)的小鼠 ES細胞 。 由于 ES細胞具有諸多方面的優(yōu)越性，故特別適合于用作基因敲除實驗 (gene knockout experiment)。 因此 ， 選擇培養(yǎng)基中的 GCV能夠特異性地殺死表達HSVtk基因的轉化細胞 。 為了克服這種困難，已經發(fā)展出了一種用于富集同源重組事件的特殊的試驗體系，它涉及到正選擇和負選擇兩個重要內容，所以特稱為 正負選擇（ positivenegative selection）法。 (3)正負選擇法 轉染 DNA與內源基因組 DNA之間的同源重組事件 ， 是由轉染 DNA的自由末端激發(fā)的 。 其主要的應用有如下幾個方面： 第一 ， 應用基因定向插入技術 ， 能夠將經體外修飾改造的突變基因或某種新的外源基因 ， 取代受體細胞核基因組上的目標基因 ， 使基因組獲得新的遺傳信息 ， 以便使科學工作者能夠相當有效地檢測基因的功能 。在哺乳動物細胞中，當 DNA同源性的有效長度介于 259—1800bp之間時，同源序列越長，基因定向插入的效率也就越高，兩者成正比； DNA同源性有效長度在 2kb以上時，基因定向插入的效率進一步提高，同源程度為 14kb時，達到最高值；實驗還觀察到，當 DNA同源序列長度不到200bp時，基因定向插入的效率則會明顯地下降。 鑒于哺乳動物基因定點整合效率低下的緣故 ， 因此掌握并利用這些影響因素 ， 對于提高基因定點插入效率無疑是十分有益的 。 基因定點插入的基本過程包括如下幾個步驟： ① 首先是將外源基因 ， 以及兩側與內源目標基因同源的 DNA片段 ， 克隆在具有選擇性標記基因(例如 neo)的載體分子上 ， 構成專用的基因定點插入載體 (gene targeting vector)； ② 選用適當的限制性內切酶切割載體 ， 使之線性化；然后轉化受體細胞 。 第二種常用的脂質轉染法叫做脂質體載體法。 6． 脂質體載體法 以脂質體為媒介的外源 DNA導入受體的方法 ， 叫做脂質轉染法 。 ※ 如果在電穿孔之前 ， 先用秋水仙酰胺(colcemid)預處理細胞 10小時 ， 可提高轉化效率 3～ 10倍 。 (2) 穿刺法 操作過程： I、 取對數生長期的細胞 ， 加入蛋白酶及EDTA溶液 ， 于 37℃ 下消化 15分鐘； II、 移去消化液 ， 并用培養(yǎng)基漂洗細胞之后 ，在每個直徑為 (1～5)x103細胞 ， 置 37℃ 下繼續(xù)培養(yǎng)過夜； III、 在穿刺前棄去培養(yǎng)基 ， 用 磷酸緩沖液 (PBS)漂洗 2次 ， 然后加入濃度為 5～ 1000181。 如把 tkDNA注射到小鼠 tk細胞 ， 結果有 50％ ～ 100％ 的受注射細胞能瞬時表達胸苷激酶的活性 。 4． 基因顯微注射技術 應用玻璃顯微注射器 ， 可以把重組 DNA直接注射到哺乳動物細胞的細胞質或細胞核 。 磷酸鈣轉染技術十分有效而且易于重復 ，但最適轉染條件的范圍比較窄 ， 為此發(fā)展出技術條件并不十分苛刻的聚陽離子 DMSO轉染技術 。 (3) DEAE葡聚糖轉染法的評價 優(yōu)點 : 方法簡單 、 重復性高 、 以及轉染效率高于磷酸鈣法等 。 大體上說 ， 按每個直徑 10cm的培養(yǎng)皿中加入 110181。最高感染率可達 80％。 注意：處理前要用等滲溶液漂洗 ， 除去培養(yǎng)液中的血清成分 。 (2)影響